TGF-β1 工作原理：从胞外复合体到核内 Smad 的分钟级时间轴

1. 分泌形式：LAP 护盾与 LTBP 外挂

• 前体蛋白：390 aa，分子量 44 kDa；C 端 112 aa 为成熟 TGF-β1，N 端 278 aa 组成 latency-associated peptide (LAP)
• 二聚体组装：两条前体链经 Cys4-Cys4 交联，形成 88 kDa 大复合物，分泌即自带“护盾”
• LTBP-1 绑定：LAP 通过 Cys33 与 LTBP-1 交联，锚定到细胞外基质；敲除 LTBP-1 后胞外潜伏池减少 70 %

2. 激活三步曲：整合素-牵引、蛋白酶剪、酸性解离

• αvβ6 整合素：结合 RGD 基序，施加 40 pN 机械力，拉开 LAP 屏蔽；β6 缺失小鼠肺内激活率下降 90 %
• MMP-2/-9：在 LAP Gly100-Leu101 间剪切，释放成熟二聚体；剪切位点突变 L101A 阻断激活
• 酸微环境：pH 5.5 下 LAP 构象松弛，t? 3 min；肿瘤微环境常用此机制，体外实验可加 100 mM 乙酸模拟

3. 受体结合：TβR-II 先握手，TβR-I 再锁臂

• 亲和常数：TGF-β1 与 TβR-II Kd 15 pM；TβR-I 加入后整体 Kd 降至 5 pM，形成 2:2:2 超级复合物
• 瞬时动力学：SPR 测定 kon 3×10? M?1s?1，koff 5×10?? s?1，停留时间 5.5 h，保证长时信号
• 受体丰度：HaCaT 细胞 TβR-II 2×10? 拷贝，TβR-I 1×10? 拷贝；过表达 TβR-I 信号放大 3 倍即出现脱敏

4. Smad 主线：磷酸化-三聚-入核 15 min 闭环

• Smad2 磷酸化：TβR-I SSXS motif 3 秒完成，位点 Ser465/467；突变 S465A 信号下降 95 %
• Smad4 三聚：p-Smad2/3 + Smad4，核质穿梭 5 min 达峰；FRET 测得胞内浓度 1.2 μM
• DNA 占位：Smad3 结合 CAGAC 盒，Chip-seq 峰值 15 min；平均占据 45 min 后自动置换

5. 非 Smad 支线：TRAF6-p38 与 PI3K-Akt 并行

• TRAF6 泛素化：TβR-I 招募 TRAF6，K63 泛素链 2 min 上线，激活 p38 MAPK；SB203580 10 μM 阻断胶原诱导
• PI3K-Akt：TβR-I 磷酸化 Tyr284 招募 p85 亚基，Akt S473 磷酸化 5 min；MK-2206 1 μM 抑制 EMT 标志物 vimentin 上调 70 %
• RhoA 激活：TGF-β1 1 ng/mL 即可诱导 RhoA-GTP 2 倍升高，细胞硬度 30 min 内增加 1.5 倍

6. 转录输出：Snail、COL1A1 与 IL-11 的三线节奏

• Snail：Smad3/4 直接结合 ?653 bp 增强子，2 h mRNA 上调 40 倍；敲除 Snail EMT 阻断 80 %
• COL1A1：?1.7 kb 区域 3 个 CAGAC 盒，4 h 转录峰值；联合 SP1 位点突变下降 60 %
• IL-11：自分泌环路，STAT3 二次放大，8 h 蛋白水平 500 pg/mL；阻断 gp130 抗体可将胶原分泌降回基线

7. 负反馈：Smad7 与 SKI 的 30 min 刹车

• Smad7 转录：Smad2/3 结合启动子，30 min 达峰；过表达 Smad7 使 p-Smad2 半衰期从 45 min 缩短至 8 min
• SKI 降解：Smurf2 介导 SKI 泛素化，2 h 清除；SKI 残留高时 COL1A1 诱导被压制 50 %
• miR-29b：TGF-β1 下调 miR-29b 5 倍，解除对 COL1A1 3′UTR 抑制；miR-29b mimic 能把胶原降回基线

8. 实验读数：磷酸流到双报告

• 磷酸流：p-Smad2 S465/467 抗体 AF647，1:200，4 °C 破膜 15 min；CV <5 %，可测 0.02 ng/mL TGF-β1
• 双报告基因：(CAGA)??-SEAP + SBE-Luc，6 h 上线，线性范围 0.05–10 ng/mL；适合中和抗体高通量筛选
• Incucyte EMT：N-cadherin GFP 敲入，48 h 荧光强度提升 6 倍；实时记录无需固定，减少假象

9. 空间记忆：胞内持续池

• 持续磷酸化：刺激 1 h 后洗脱，p-Smad2 仍维持 4 h；与受体再循环相关，chloroquine 100 μM 可缩短至 1 h
• 胞外潜伏库：LTBP-1 锚定型在基质留存 24 h；机械牵拉 10 % 拉伸即可二次激活，无需新鲜配体
• 染色质驻留：Smad3 平均停留 45 min，H3K27ac 水平升高维持 8 h；形成“可再触发”染色质环境