工作原理：把细胞“泡”成溶液，而不是“煮”成浆

WB (IP) Lysis Buffer 的核心是 20 mM Tris-HCl pH 7.4 的等渗环境，加上 0.5 % Nonidet P-40 戳破质膜，胆固醇被瞬时溶解，胞浆蛋白像水一样释出；150 mM NaCl 维持离子强度，防止核糖体解离成黏团。整个裂解过程 4 °C 进行，蛋白酶体复合物保持完整，做 Co-IP 时靶蛋白依旧挂在伴侣蛋白上，不会被“热裂解”打散。

去垢剂浓度梯度：0.1 %、0.5 %、1 % NP-40 谁决定核污染

0.1 % NP-40 只破外膜，核膜完好，核蛋白漏出率 < 5 %；0.5 % 时核膜出现小孔，Histone H3 在 WB 里灰度 0.3；1 % 以上核膜碎裂，DNA 释放让裂解液黏成拉丝，IP 时磁珠被基因组缠成块。标准配方停在 0.5 %，既拿到胞浆胞膜蛋白，又避开 DNA 干扰，是做 IP 的“安全区”。

蛋白酶抑制剂：EDTA 1 mM 把金属蛋白酶“锁死”

Calpain、MMP 需要 Ca2? 激活，EDTA 1 mM 把游离 Ca2? 拉到 10?? M，金属蛋白酶瞬间休眠。Serine 蛋白酶抑制剂 PMSF 半衰期 30 min，改用 1 mM AEBSF，4 °C 稳定 6 h，IP 孵育过夜也不怕靶蛋白被“啃”成碎片。瓶身双色盖：白盖含 EDTA，做 IP 用；红盖无 EDTA，留给磷酸酶实验，避免 EDTA 把 Mn2? 一起螯合，导致磷酸化条带消失。

磷酸酶抑制剂：β-甘油磷酸 10 mM 让 Akt 磷酸化撑住 24 h

PP2A 在 4 °C 仍有 30 % 活性，β-甘油磷酸 10 mM 竞争性占位，p-Akt Ser473 信号 24 h 不衰减。Na?VO? 1 mM 抑制酪氨酸磷酸酶，Src p-Tyr416 灰度维持 90 %。做磷酸化 Co-IP 时，裂解液里缺这一勺，Western 只剩“裸抗”条带，磷酸化信号被洗成白板。

裂解体积算法：100 mm 皿加 200 μL 让蛋白浓度一次到位

100 mm 皿细胞数 1 × 10?，用 200 μL Lysis Buffer，拿到 2.5 μg μL?1 总蛋白，一次上样 20 μL 就是 50 μg，WB 内参灰度 60 % 不过曝。体积加到 500 μL，浓度稀释到 1 μg μL?1，需要冻干浓缩，多走一步丢 20 % 样本。说明书给一张“皿-体积”对照表，贴在超净台墙，新手不会再问“该加多少”。

DNA 清除：Benzonase 1 U mL?1 30 s 把黏度降到水线

基因组释放让裂解液黏成蜂蜜，1 U mL?1 Benzonase 30 s 把 DNA 切成 2–5 bp，黏度降到 1.0 cP，磁珠不再被缠成“蜘蛛网”。酶切后 4 °C 不沉淀，IP 洗涤 3 次磁珠仍分散，背景从 15 降到 3 灰度单位。

现场验收：250 ng BSA 标准 5 min 溶解即合格

新到一瓶 WB (IP) Lysis Buffer，取 250 ng BSA 标准，加 100 μL 裂解液，4 °C 摇 5 min，Bradford 测回收率 ≥ 95 %，pH 计读 7.4 ± 0.1 即签字收货。5 min 完成验收，比测去垢剂浓度省事，现场就能判定退货还是留用。