TGF-β2 技术参数：从蛋白序列到质控放行的硬核清单

1. 基因坐标与转录本

• 染色体定位：1q41，长度 37 kb，7 外显子
• 参考序列：NM_003238.4，2 226 bp，编码 414 氨基酸前体
• 信号肽：1–19 aa，剪切后分泌；突变 A5V 导致分泌效率下降 35 %

2. 蛋白结构快照

• 分子量：成熟二聚体 25.0 kDa（单体 12.5 kDa），SDS-PAGE 表观 28 kDa 由糖基化贡献
• 二硫桥：Cys4–Cys108、Cys15–Cys78 锁定单体；二聚体通过 Cys77 间桥接，还原后生物活性归零
• 晶体结构：PDB 3KFD，分辨率 1.8 ?，与 TGF-β1 RMSD 0.35 ?，表面静电差异集中在 α2 螺旋

3. 糖基化与翻译后修饰

• N-糖基化位点：Asn42，复杂型双天线，CHO 表达产物唾液酸化 32 %
• 磷酸化：蛋白激酶 C 在 Thr60 体外标记，占循环蛋白 <5 %，功能未知
• O-连接：无；去糖基化不影响受体结合，但热稳定性下降 4 °C

4. 受体亲和与动力学

• TβR-II 结合：Kd 12 pM，kon 2.8×10? M?1s?1，koff 3.4×10?? s?1，停留时间 8.2 h
• TβR-I 招募：形成 2:2:2 复合物后整体 Kd 3 pM；与 TGF-β1 相比亲和高 1.4 倍
• β-聚糖辅助：β-聚糖过表达使表面结合增加 40 %，但不下传信号，仅作储备池

5. 活性单位与比活性

• WHO 标准：NIBSC 89/514，1 IU = 0.025 ng TGF-β2；比活性 4×10? IU/mg
• ED50 定义：Mv1Lu 细胞生长抑制，ED50 0.05 ng/mL；批次 CV 必须 <10 %
• 荧光报告：HEK-Blue TGF-β 细胞，EC50 0.08 ng/mL，斜率 ?1.9 至 ?2.3，偏离即判不合格

6. 纯度与杂质限度

• SDS-PAGE 单带 ≥99 %：银染无杂带；出现 14 kDa 条带提示二硫键还原，活性下降 80 %
• HPLC-SEC：主峰 ≥98 %，聚集体 <1 %；聚集体诱导树突细胞 CD83 假阳性升高 3 倍
• 内毒素：临床级 <0.05 EU/μg；细胞治疗级 <0.01 EU/μg，高于此值 Treg 诱导失败

7. 稳定性与保存

• 液体：4 °C 两周活性下降 6 %，添加 0.1 % HSA 可降至 2 %
• 冻干：5 % 海藻糖 + 0.01 % Tween-20，25 °C 加速 28 天聚集率 <1 %，活性保持 >95 %
• pH 窗口：5.0–8.0 最稳定；pH 3.0 下 10 min 铁释放型构象，恢复中性后单体占 70 %

8. 检测技术参数

• ELISA：R&D DY302，检测范围 15–1 000 pg/mL，批内 CV 4 %，批间 7 %
• Luminex：Milliplex HSTCMAG-28SK，与 TGF-β1、β3 交叉 <2 %，可三因子同板
• Simoa：LOD 0.1 pg/mL，CV 5 %，脑脊液微量样本 10 μL 即可，评估眼内屏障渗漏

9. 重组工艺对比

• CHO：糖基化真型，产量 800 mg/L，成本 ￥10 k/g；临床级首选
• E. coli：无糖基，包涵体复性得率 1.2 g/L，成本 ￥2 k/g，适合晶体或抗体制备
• Pichia：高甘露糖型，产量 2 g/L，内毒素 <0.01 EU/μg，动物免疫佐剂研究常用

10. 质控放行硬指标

• N端测序：前 20 aa 必须与 UniProt P61812 一致，任何截短即判不合格
• 二硫桥完整：Ellman 试剂测游离巯基 <0.1 nmol/mg，高于 0.5 nmol 拒收
• 病毒清除：3 步层析 + 20 nm 纳滤，累计 LRV ≥12；支原体 28 天培养阴性，符合 EP 2.6.7