CCL5 工作原理：从胞内颗粒释放到整合素激活的秒级时间轴

1. 基因速览与转录开关

• 染色体定位：17q12，长度 8.2 kb，含 3 个外显子；启动子区 ?220 bp 有 NF-κB 与 IRF-1 双位点
• 即时转录：TNF-α 10 ng/mL 刺激 30 min，mRNA 上调 150 倍；放线菌酮不能阻断，归为早期基因
• 表观加速：H3K27ac 在 ?120 bp 增强子富集 6 倍，CRISPR-dCas9 去乙酰化后诱导效率降 60 %

2. 翻译后修饰决定功能走向

• 信号肽切除：1–23 aa 在内质网完成，突变 L23P 导致分泌效率下降 70 %
• 酪氨酸硫酸化：Tyr 27 被 TPST-2 修饰，增强 CCR5 亲和力 3 倍；TPST-2?/? 趋化活性减半
• N 端截短：CD26/DPPIV 切除 2–4 aa，生成 7–68 形式，保留 CCR1/3 结合，失去 CCR5 信号，炎症后期天然刹车

3. 受体谱与亲和阶梯

• CCR1：Kd 2.3 nM，Gi/o 偶联，钙流 EC50 0.8 nM，单核细胞迁移主力
• CCR3：Kd 18 nM，嗜酸粒细胞专用，与 eotaxin-2 协同指数 1.8
• CCR5：Kd 0.9 nM，T 细胞与巨噬细胞共享，HIV-1 gp120 竞争结合，IC50 50 nM
• 糖胺聚糖：硫酸乙酰肝素 Kd 50 nM，表面吸附形成 2 μm 梯度，决定体内方向性

4. 信号动力学：钙流-PI3K-ERK 三连击

• 钙流峰值：100 ng/mL CCL5 刺激 15 s 达 400 nM，持续 45 s；CCR5 敲除细胞降至 50 nM
• PI3Kγ：p110γ 招募 30 s，PIP3 荧光探针报告 1.5 倍增益；LY294002 100 nM 阻断趋化 90 %
• ERK1/2：磷酸化 5 min 达峰，shRNA Rap1 下降 60 %，说明 Ras-ERK 与 Rap1 并行

5. 细胞输出：趋化、脱颗粒与超氧化物

• 趋化：THP-1 细胞，Transwell 5 μm，ED50 0.6 nM；梯度斜率 1 % 即可定向，CCR1 阻断抗体降低 70 %
• 嗜酸粒细胞脱颗粒：CD63 表面化 15 min，EC50 1.2 nM；CCR3 抗体 6C7 10 μg/mL 完全抑制
• 呼吸爆发：ROS 产量 10 min 上线，最大 3.2 倍；DPI 10 μM 证明 NOX2 为主

6. 体内半衰期与梯度构建

• 血浆 t1/2：小鼠 7 min，人 15 min；肾小管刷状缘 megalin 介导清除，敲除延长到 45 min
• 基质吸附：硫酸乙酰肝素结合后局部浓度可达 500 ng/mL，游离仅 5 ng/mL；肝素酶 III 处理梯度消失
• 血小板源释放：凝血酶 0.5 U/mL 刺激后，每 10? 血小板释放 2 ng CCL5，动脉损伤处瞬时浓度 50 ng/mL

7. 负反馈与受体脱敏

• GRK 磷酸化：CCR5 C 端 Ser/Thr 簇 2 min 完成，β-arrestin2 招募，内化率 60 %，恢复半衰期 90 min
• DARC 诱饵：红细胞 Duffy 抗原 Kd 12 nM，吸附游离 CCL5，炎症模型 KO 小鼠趋化距离增加 1 倍
• CD26 截短：生成 7–68 形式，自身无信号但占据受体，天然拮抗，血浆中占总量 15 %

8. 实验读数方案

• 实时钙流：Fluo-4 AM，1×10? 细胞，100 ng/mL 刺激，15 s 峰值，CV <3 %，可测 3 pM 水平
• 趋化芯片：IBIDI μ-Slide，1 % 线性梯度，30 min 后跟踪 120 细胞，速度 8 μm/min，方向性指数 0.75
• 磷酸化流：CCR1 pERK 抗体 AF488，4 °C 破膜 10 min，ED50 0.7 nM，与迁移曲线重叠度 98 %

9. 病毒挟持与药物切入

• HIV-1 竞争：gp120 与 CCL5 共享 CCR5 口袋，SCH-C 拮抗剂 Ki 0.4 nM，保留趋化，阻断病毒感染
• Maraviroc 验证：临床浓度 1 μM 使 CCL5 钙流下降 95 %，但 CCR1 信号完好，提示受体选择性