CCL11/Eotaxin 操作使用：把嗜酸性粒细胞迁移做成可重复的标准动作

1. 实验前安全线

• 粉末冻干品含 0.1 % BSA 载体，开盖即视为无菌失效；若用于后续动物注射，先用 0.22 μm PVDF 低蛋白吸附滤膜过滤，损失率 <5 %。
• 个人防护：CCL11 对黏膜有趋化刺激，粉末称重戴好 P2 口罩，防止喷嚏连环污染。

2. 复溶与分装

• 推荐用 1×PBS+0.05 % Tween-20，体积按「终浓度 100 μg/mL」计算，缓慢沿壁加入，涡旋 3 s 即可，禁止剧烈摇晃，防止二聚体升高 10 %。
• 立即按单次用量 50 μL/管预分装，液氮速冻后 -80 ℃，6 个月内用完；第 3 次冻融后生物活性下降 18 %，Transwell 会出现假阴性。

3. 浓度梯度设置

• 体外趋化：起始 100 ng/mL，3 倍稀释 7 点，EC?? 落在 8–12 ng/mL；低于 1 ng/mL 背景与随机迁移重叠，高于 300 ng/mL 出现脱敏。
• 小鼠气管滴注：常用 1 μg/50 μL，4 h BALF 嗜酸细胞升高 4 倍；超过 5 μg 会触发中性粒细胞混杂，流式圈门难度加大。

4. 细胞外液环境

• Ca2? 浓度 1 mM 是触发整合素信号的关键，低于 0.5 mM 细胞速度降 40 %；Mg2? 仅需 0.4 mM，过量会竞争性抑制 Ca2? 通道。
• pH 7.2–7.4 区间迁移指数最高，降到 6.8 嗜酸细胞存活率仍 >95 %，但方向性丢失，伪足呈圆周摆动。

5. 嗜酸性粒细胞纯化速通

• 人外周血：用 Percoll 1.082 两步离心，30 min 拿到 >90 % 纯度；CD16 负选磁珠再踩一脚，纯度升到 98 %，耗时增加 20 min，值得。
• 小鼠骨髓：IL-5 分化 7 天，收获率 5×10? 细胞/股骨，Day10 后 CCR3 表达开始下调，趋化响应打对折，时间窗别拖。

6. 实时迁移记录

• 96 孔 Boyden 小室：5 μm 聚碳酸酯膜，先 37 ℃ PBS 润膜 10 min，防止气泡堵孔；下室加 220 μL 含药培养基，上室 5×10? 细胞/100 μL，90 min 固定染色。
• 微流控芯片：通道高度 6 μm，细胞需稀释到 1×10? /mL，否则堆叠影响轨迹；每隔 30 s 拍照，用 ImageJ “Manual Tracking” 插件，输出 CSV 直接算方向持续性。

7. 读数与统计

• 细胞计数：显微镜 200× 视野取 5 个固定行，平均后乘系数 2.75 即每孔总数；自动计数仪需设圆度 0.85–1.0，避免碎片误报。
• 统计：每组 ≥3 独立供体，趋化指数用 Kruskal-Wallis 比较，P<0.05 视为有效；单独 t 检验会放大个体差，容易被审稿人质疑。

8. 常见故障排查

• 背景高：膜未润湿或上室液面溢出，细胞掉进下室；把板子重新离心 5 min × 300 g，再染色可区分真假迁移。
• 信号弱：缓冲液存放 >2 周，谷氨酰胺降解，细胞能量不足；现配现用或在 2 ℃暗处保存 ≤48 h。
• 梯度塌陷：孔间距离太近， incubator 开关门震动导致扩散；用独立小室盒固定，减少搬动。

9. 配套试剂兼容

• 阻断抗体：抗 CCR3 克隆 5E8，终浓度 10 μg/mL，预孵育 15 min 即可完全抑制迁移，验证特异性必备。
• 染色液：Giemsa 1× 5 min 快速染色，PBS 漂洗 2 次，背景干净；Wright-Giemsa 需 10 min，时间翻倍效果相似。

10. 实验废弃处理

• 接触过细胞的枪头、培养皿置入 84 消毒液 1:50 浸泡 30 min，再按生物危害丢弃；CCL11 可吸附在塑料表面，直扔可能造成气溶胶污染。
• 剩余高浓度母液用 1 M NaOH 中和 1 h，活性降解 >99 %，降低环境排放风险。