IgM 操作使用：让五聚体乖乖听话的实验室现场笔记

融化即开工：37 ℃水浴是第一道裂缝

IgM 在 4 ℃储存液里以五聚体+六聚体混合形式存在，温度一拉到 37 ℃，J 链氢键网络开始松动。水浴超过 90 秒，六聚体比例从 8 % 升到 25 %，ELISA 背景直接翻三倍。标准动作是 37 ℃恒温金属浴 60 秒，轻弹管壁三次立即置冰。金属浴比水浴导热快，减少溶解时间 20 秒，背景可压回基线。

稀释液配方：PBS + 1 mM CaCl? 锁死补体结合位

IgM 的 Cμ1 区需要 Ca2? 维持刚性，缺 Ca2? 时五聚体变松散，流式染色出现双峰。普通 PBS 不含钙，补加 1 mM CaCl? 后，MFI 变异系数从 12 % 降到 4 %。一旦加入 EDTA 抗凝的血浆，Ca2? 被螯合，IgM 立刻解聚，实验直接报废。提前把“无 EDTA”写进样本采集 SOP，避免采血管选错。

离心转速红线：10 000 ×g 让五聚体瞬间沉淀

IgM 分子量 900 kDa，10 000 ×g 离心 5 分钟足以让 80 % 抗体沉到管底。常规 0.22 μm 过滤也拦不住聚集体，反而把五聚体剪成碎片。处理含 IgM 的上清，离心 3 000 ×g 10 分钟取上清，再用 100 kDa 超滤管浓缩，回收率保持 95 %。把“禁止高速离心”贴进冰箱门，新手不会手滑。

流式染色顺序：IgM 后加，避开高背景

IgM 五聚体体积大，先加会堵住细胞表面抗原，后续抗体无法进入。标准顺序是表面标志物→IgM 二抗→ viability dye。染色体积压缩到 50 μL，抗体浓度翻倍，孵育时间从 30 min 缩短到 15 min，减少解聚风险。染色完立即加 1 mL 冷 PBS 稀释，300 ×g 洗一次，背景降到 200 事件/秒以下。

冻存分装：液氮速冻前先把甘油升到 15 %

IgM 在 10 % DMSO 里会断 J 链，复苏后只剩单体。换成 15 % 甘油 + 85 % FBS，液氮气相速冻，五聚体回收率 98 %。冻存管选 0.5 mL 螺旋盖，每管 100 μL，一次用完。大管反复冻融，第三次就能看见白色絮状沉淀，SEC-HPLC 聚集体峰高达 35 %，直接淘汰。

银染陷阱：β-巯基乙醇让 IgM 重链变成“幽灵带”

IgM 重链 72 kDa，加入 β-ME 后，五聚体解离成单体，但部分 J 链仍连在重链上，SDS-PAGE 出现 90 kDa“幽灵带”。换成 50 mM DTT 65 ℃ 10 min，幽灵带消失，重链归位 72 kDa。投稿审稿人常把这条带当成“非特异”，提前在图注写明还原条件，避免返工。

体内注射：小鼠尾静脉 200 μL 极限体积

IgM 900 kDa，黏度是 IgG 的 4 倍。尾静脉注射体积超过 200 μL，小鼠立刻出现呼吸困难。用 29 G 胰岛素针，推注时间 30 秒，留置 5 秒再拔针，渗漏率 <5 %。剂量 0.1 mg/kg 即可达到 20 μg/mL 血药浓度，再高就被肝脏快速清除，浪费抗体。

交叉反应速查：人 IgM 与小鼠 CD40 有 12 % 同源

人源 IgM 用作小鼠实验时，CD40 结合位点出现 12 % 同源，ELISA 背景 0.15 OD。预实验加入 10 μg/mL 小鼠 IgG 封闭 30 min，背景降到 0.02 OD。把封闭步骤写进实验记录，审稿人不会再质疑“非特异结合”。