活细胞示踪试剂盒工作原理详解

试剂盒组成及作用

活细胞示踪试剂盒主要包含荧光染料、细胞膜染料、细胞核染料等。荧光染料用于标记和观察活细胞的动态变化，细胞膜染料选择性标记细胞膜，使细胞膜在荧光显微镜下清晰可见，细胞核染料用于标记细胞核，便于观察细胞核的变化。这些组分在示踪过程中发挥关键作用，协同工作实现活细胞的精准示踪。

荧光染料标记原理

选择合适的荧光染料

常用的荧光染料有 Calcein-AM、CFDA-SE、DiI 等。Calcein-AM 是一种常用的活细胞示踪染料，具有良好的细胞膜通透性，可穿过细胞膜进入细胞内。在细胞内，Calcein-AM 被细胞内的酯酶切割，生成具有荧光的 Calcein，从而标记活细胞。CFDA-SE 是一种基于羧基荧光素（FITC）的染料，具有良好的稳定性和荧光强度，可通过细胞膜上的氨基反应与细胞内蛋白质共价结合，实现长期示踪。DiI 是一种脂溶性膜染料，可插入细胞膜磷脂双分子层中，标记细胞膜，具有良好的稳定性和低细胞毒性。

染料的标记过程

将活细胞与荧光染料在适宜条件下孵育，使染料进入细胞并与细胞内成分结合。例如，使用 Calcein-AM 时，通常将细胞与 1 - 10 μM 的 Calcein-AM 溶液在 37℃、5% CO?的培养箱中孵育 15 - 30 分钟。孵育过程中，Calcein-AM 进入细胞，转化为具有荧光的 Calcein，标记活细胞。孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞，去除未进入细胞的染料。孵育时间和温度需根据具体染料和细胞类型优化，以获得最佳标记效果。

荧光信号的产生与检测

荧光信号的产生

荧光染料在特定波长的激发光照射下发出荧光。例如，Calcein 的激发波长为 490 - 515nm，发射波长为 515 - 530nm。当激发光照射到标记有 Calcein 的细胞时，Calcein 分子吸收光能，从基态跃迁到激发态，然后从激发态回到基态，释放出荧光。荧光信号的强度与标记细胞的数量和标记效率相关，可用于定量分析细胞数量和活性。

荧光信号的检测

使用荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号。荧光显微镜可直观观察细胞形态和荧光分布，选择合适的激发滤光片和发射滤光片，以获得清晰的荧光图像。例如，使用 488nm 激光激发 Calcein，通过 525nm 附近发射滤光片检测荧光信号。流式细胞仪则可快速分析大量细胞的荧光强度，实现细胞群体的定量分析。根据荧光信号的强弱和分布，区分标记细胞和未标记细胞，评估细胞活性和示踪效果。

试剂盒的优势与应用领域

优势

• 高灵敏度：荧光染料具有较高的荧光强度和稳定性，能清晰地标记活细胞，即使在低浓度下也能检测到微弱的荧光信号。
• 低细胞毒性：染料经过特殊设计，对细胞活性影响较小，在细胞正常生理状态下可长期示踪。
• 多重标记能力：可同时使用多种荧光染料标记细胞的不同结构和功能，实现多重示踪。

应用领域

• 细胞迁移和侵袭研究：标记细胞后，通过实时成像技术观察细胞在体外或体内的迁移和侵袭行为，研究肿瘤细胞的转移机制。
• 细胞分化和发育研究：标记干细胞或前体细胞，追踪其分化和发育过程，揭示细胞命运决定的分子机制。
• 药物筛选和毒性评估：标记细胞后，评估药物对细胞活性、迁移和分化的影响，筛选潜在的药物候选。