活/死细胞双染色试剂盒操作使用指南

概述

活/死细胞双染色试剂盒在细胞分析领域应用广泛，可精准区分活细胞与死细胞，助力细胞活性评估、药物筛选及细胞凋亡研究等。其操作简便、灵敏度高，结果可通过荧光显微镜或流式细胞仪直观呈现。

前处理

细胞准备

无论是悬浮细胞还是贴壁细胞，在进行双染色前需确保细胞状态良好，密度适宜。细胞密度过高或过低均会影响染色效果及后续检测准确性。悬浮细胞直接取适量细胞悬液，用预冷的 PBS 洗涤 2 - 3 次，离心去除培养基及杂质。贴壁细胞则先用胰酶消化，制成单细胞悬液，再按上述方法洗涤。洗涤过程动作轻柔，避免细胞过度离心导致损伤。

试剂准备

活/死细胞双染色试剂盒通常包含两种荧光染料，一种用于标记活细胞，如绿色荧光染料 Calcein-AM，另一种用于标记死细胞，如红色荧光染料 PI（碘化丙啶）。使用前，先检查试剂是否在有效期内，是否有变色、沉淀等现象。若有异常，不可使用。取适量染料，按试剂盒说明书推荐的比例用无菌水或 PBS 稀释，配制成工作液。例如，Calcein-AM 常用浓度为 1 - 10 μM，PI 常用浓度为 1 - 20 μg/mL。配制好的工作液应立即使用，避免长时间放置导致活性下降。

染色步骤

加入染色液

将准备好的细胞悬液与染色工作液按一定比例混合，轻轻吹打混匀，使染料均匀分布于细胞周围。对于 96 孔板培养的细胞，一般每孔加入 100 μL 染色工作液和 10 μL 细胞悬液，确保细胞充分接触染料。

孵育

置于 37℃、5% CO?的培养箱中孵育 15 - 30 分钟。孵育时间不宜过长，否则可能影响细胞活性，导致染色结果偏差。孵育过程中，细胞摄取染料并进行代谢反应。Calcein-AM 在活细胞内经酯酶作用转化为具有荧光的 Calcein，发出绿色荧光；PI 则能穿透死细胞破损的细胞膜，与细胞核中的 DNA 结合，发出红色荧光。

观察与记录

荧光显微镜观察

孵育结束后，立即将染色后的细胞置于荧光显微镜下观察。选择合适的激发波长和发射波长，Calcein-AM 的激发波长为 490 - 515nm，发射波长为 515 - 530nm；PI 的激发波长为 535nm，发射波长为 617nm。通过调整光强和焦距，清晰看到绿色荧光标记的活细胞和红色荧光标记的死细胞，可拍摄多张照片，记录细胞形态及分布情况。

流式细胞仪分析

对于高通量、定量分析，将染色后的细胞用流式细胞仪检测。设置合适的荧光通道，收集至少 10?个细胞的信号，得到散点图，横轴为 PI 荧光强度（代表死细胞），纵轴为 Calcein-AM 荧光强度（代表活细胞）。根据细胞在图中的分布情况，准确计算活细胞和死细胞的比例。

注意事项

操作环境

整个操作过程需在无菌环境下进行，避免杂菌污染影响细胞状态及染色结果。使用无菌移液器、离心管等器具，细胞培养箱、超净工作台等设备定期清洁消毒。

细胞处理

操作细胞时动作轻柔，避免用力吹打或剧烈振荡，防止细胞受损。细胞计数时，使用血细胞计数板准确计数，确保细胞浓度符合实验要求。

试剂使用

严格按照试剂盒说明书操作，不同品牌、型号的试剂盒组分和使用方法可能存在差异。使用过程中，避免染料接触皮肤和眼睛，一旦接触，立即用大量清水冲洗。

后续处理

实验结束后，妥善处理废弃物，如含染料的废液、一次性耗材等，避免对环境造成污染。将未用完的试剂按说明书要求保存，如 4℃避光保存，以备下次使用。