乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒实验解决方案

发表时间：2025-01-20

原理

乳酸脱氢酶（LDH）是一种氧化还原酶（EC1.1.1.27），广泛存在于各种生物体中。它催化丙酮酸和乳酸相互转化，同时伴随着NADH 和NAD+的相互转化。在缺氧条件下，它将糖酵解的最终产物丙酮酸转化为乳酸。LDH定量是有临床意义的，因为某些LDH同工酶的血清水平反映了特定组织中的病理条件。当疾病、伤害或有毒物质损害组织时，细胞的乳酸脱氢酶释放到血液中。由于乳酸脱氢酶是一种相当稳定的酶，因此它已被广泛用于评估组织和细胞的损伤和毒性。CheKine? 乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒（微量法）提供了一种简单、简便的微量法，用于测定动植物组织、细胞、细菌、血清（浆）和其他生物液中的乳酸脱氢酶。在此微量法中，LDH将NAD还原为NADH，NADH与WST-8相互作用产生颜色，从而进行比色测定(λmax=450 nm）。

自备耗材

·酶标仪或可见分光光度计（能测450 nm处的吸光度）

·恒温箱、制冰机、低温离心机

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

·去离子水

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

1×Assay Buffer: 使用前，Assay Buffer (5×)用去离子水稀释5倍，浓度为1×Assay Buffer，平衡到室温；4℃保存。

Lactate: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。

NAD: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。

WST-8: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。

Enhancer: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。

Working Reagent：每孔准备55 μL工作液，现配现用：吸取31 μL 1×Assay Buffer，8 μL NAD, 5 μL WST-8, 1 μL Enhancer和10 μL Lactate混合均匀。

Lactate Dehydrogenase Standard (20 U/mL)：把20 μL Lactate Dehydrogenase Standard (1 KU/mL)用980 μL 1×Assay Buffer稀释至20 U/mL，混合均匀；冰上避光放置；不稀释的标准品分装保存于-20℃。

标准曲线设置：按下表所示，用1×Assay Buffer将20 U/mL标准品稀释为20、16、12、8、4、2、1 U/mL的标准溶液。

序号		20 U/mL Standard体积（μL）		1×Assay Buffer体积（μL）		标准品浓度（U/mL）
Std.1	200		0		20
Std.2	160		40		16
Std.3	120		80		12
Std.4	80		120		8
Std.5	40		160		4
Std.6	20		180		2
Std.7	10		190		1

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4 h之内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。

1.动植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL预冷的1×Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心15 min，取上清液，置冰上待测。

2.细胞（菌）：收集500万细胞（菌）到离心管内，用冷PBS清洗细胞（菌），离心后弃上清，加入1 mL 1×Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞（菌）5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），然后10,000 g，4℃离心15 min，取上清液，置冰上待测。

3.血清、血浆等液体样本：直接测定。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到450 nm，可见分光光度计用去离子水调零。

2.操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

试剂		空白孔（μL）		标准孔（μL）		测定孔（μL）
样本	0		0		50
Standards	0		50		0
去离子水	50		0		0
Working Reagent	50		50		50

1. 混匀后，37℃避光孵育30 min，测定450 nm处吸光度，空白孔记为A_空，标准孔记为A_标，测定孔记为A_测。计算ΔA_测=A_测-A_空，ΔA_标=A_标-A_空。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA_测小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA_测大于2.0，样本可用1×Assay Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为y轴，ΔA_标为x轴，绘制标准曲线。

2. LDH含量的计算

将样本的ΔA_测代入方程得到y值（U/mL）。

(1) 按样本鲜重计算

LDH含量 (U/g 鲜重)=y×V_样÷(W×V_样÷V_样总)×n=y÷W×n

(2) 按蛋白浓度计算

LDH含量 (U/mg 蛋白)=y×V_样÷(V_样×Cpr)×n=y÷Cpr×n

(3) 按样本体积计算

LDH含量 (U/mL)=y×V_样÷V_样×n=y×n

(4) 按细胞（菌）数量计算

LDH含量 (U/10⁴ cells)=y×V_样÷(500×V_样÷V_样总)×n=y÷500×n

V_样：加入样本体积，0.05 mL；W：样本质量，g；V_样总：加入1×Assay Buffer体积，1 mL；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞（菌）总数，500万。

结果展示

Figure 1. LDH的标准曲线。数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线

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