超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒实验解决方案

发表时间：2025-01-20

原理

超氧化物歧化酶（SOD，EC1.15.1.1）是催化超氧阴离子歧化成O2和H2O2的酶。它们是抗暴露于O2的所有细胞中超氧化物自由基毒性的重要抗氧化剂。异常的SOD活动与肌萎缩侧索硬化，围产期致死，神经紊乱和癌症等疾病有关。超氧化物歧化酶有三大类：Cu/Zn，Fe/Mn和Ni型。人体中存在三种形式的超氧化物歧化酶。SOD1位于细胞质中，SOD2位于线粒体中，SOD3位于细胞外。CheKine? 超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（微量法），提供一种简单易用的测定法，用于定量测定血清，血浆，组织/细胞和其它生物体液中的SOD酶活性。超氧阴离子（O2-）来源于黄嘌呤氧化酶（XO）催化反应。O2-与四唑盐WST-8反应生成水溶性甲瓒。SOD清除O2-，因此产生更少的显色反应。用比色法测定了SOD在450 nm处的抑制活性。SOD的活性与甲臜的生成量成负相关。

自备耗材

·酶标仪或可见分光光度计（能测450 nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

·水浴锅，离心机

·去离子水

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

注意：各组分开盖前，请先低速离心。

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Sample Diluent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

1×Lysis Buffer：使用前，平衡到室温，Lysis Buffer (5×)用去离子水稀释至1×Lysis Buffer，4℃保存。

WST-8：即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。

Enhancer：即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。

注意：Enhancer正常为紫红色溶液，如遇发黄，请与Abbkine工作人员联系。

Xanthine：即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装保存于-20℃。如果该组分出现浑浊，使用前请短暂涡旋。

Working Xanthine Oxidase：Xanthine Oxidase分装保存于-20℃；用Sample Diluent将Xanthine Oxidase 1:20的稀释的到Working Xanthine Oxidase，临用前配制，整个实验过程中，冰上避光放置。

Working Reagent：临用前配制；每孔吸取148 μL Assay Buffer，10 μL Xanthine, 5 μL WST-8, 1 μL Enhancer，混匀后待用。

样本制备

1.动物组织样本：称取0.1 g组织加入1 mL预冷的1×Lysis Buffer将样本进行匀浆。匀浆后的样本，4℃, 12,000 g离心5 min，取上清进行检测。

2.细胞样本：收集5×106个细胞，用预冷的PBS洗细胞，800 g离心2 min，弃上清。加入1 mL预冷的1×Lysis Buffer悬浮细胞，冰上孵育10 min后，4℃, 12,000 g离心5 min，取上清进行检测。

注意：如果需要分别检测胞浆和线粒体的SOD活性，组织/细胞样本的制备，请参考Mattiazzi et al (2002). JBC 277:29626-33。

3.血清、血浆样本：按常规方法收集血清，Sample Diluent稀释后即可作为血清样本进行检测；用抗凝管收集血液，颠倒混匀。4℃，600 g离心10 min，移取上清至另一新的离心管中，适量Sample Diluent稀释后即可作为血浆样本进行检测。

4.植物样本：称取0.1 g新鲜植物样本，加入1 mL预冷的1×Lysis Buffer进行超声波破碎。超声波破碎3 min（功率30%或300 W，超声3 s，间隔7 s），4℃，12,000 g离心5 min后，取上清进行检测。

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。处理好的样本须当天检测。测定过程中样本在冰上放置，以免变性和失活。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到450 nm，可见分光光度计用去离子水调零。

2.测定前将Working Reagent在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）孵育5 min以上。

3.在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：

试剂	样本孔（μL）	样本对照孔（μL）	空白孔（μL）	空白对照孔（μL）
样本	20	20	0	0
Working Xanthine Oxidase	40	0	40	0
Sample Diluent	0	40	20	60
Working Reagent	164	164	164	164

1. 充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）孵育30 min后，450 nm处测定各孔吸光值A。计算ΔA_样本=A_样本-A_样本对照，ΔA_空白=A_空白-A_空白对照。

注意：空白孔和空白对照孔只需各做2-3孔；不同背景颜色的样本需要各设置一个对照孔，去除样本本身的背景色。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 抑制百分率的计算

抑制百分率=(ΔA_空白-ΔA_样本) ÷ΔA_空白×100%

注意：尽量使样本的抑制百分率在10-90%范围内。如果计算出来的抑制百分率小于10%或大于90%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需将样本用Sample Diluent适当稀释；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本。

2. SOD酶活性单位：在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(U/mL)。

3. SOD酶活性计算：

(1) 血清（浆）SOD活力计算：

SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V_反总]÷V_样×n=11.2×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×n

(2) 组织和细胞SOD活力计算：

a. 按样本蛋白浓度计算

SOD活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V_反总]÷(V_样×Cpr)×n=11.2×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr×n

b. 按样本鲜重计算

SOD活性(U/g 鲜重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V_反总]÷(W×V_样÷V_样总)×n=11.2×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W×n

c. 按细胞数量计算

SOD活性(U/10⁴ cells)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V_反总]÷(500×V_样÷V_样总)×n=0.0224×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×n

V_反总：反应体系总体积，0.224 mL；W：样本质量，g；V_样：加入反应体系中样本体积，0.02 mL；V_样总：加入1×Lysis Buffer体积，1 mL；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞总数，500万。

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