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过氧化物酶（POD）活性检测试剂盒实验解决方案
发表时间：2025-01-20
原理
过氧化物酶，POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。POD催化H2O2氧化特定底物生成有色物质，在460 nm有特征光吸收。可以检测植物、细菌、细胞、血清等样本。
自备耗材
·酶标仪或可见分光光度计（能测460 nm处的吸光度）及恒温培养箱
·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
·去离子水
·匀浆器（组织样本）
试剂准备
Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
Substrate：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
H2O2：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
样本制备
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定过程中样本在冰上放置，以免变性和失活。
1.植物样本：用冷的PBS清洗植物组织，吸干组织上的水分，尽可能剪碎，称重，加入1 mL/0.1 g预冷的Extraction Buffer。对于植物纤维不多的植物组织快速冰上匀浆，匀浆后的样本，4℃，8,000 g离心10 min，取上清待测。对于植物纤维较多的植物组织冰浴超声波破碎（功率300 W，超声3 s，间隔7 s，总时间3 min），然后4℃，8,000 g离心10 min，取上清待测。
2.细菌或细胞样本：收集每次检测所需的细胞或细菌数量（约1-2×106个细胞或细菌），首先用冷PBS清洗细胞2次（用PBS重悬细胞或细菌，4℃，600 g离心10 min），按5×106个细胞或细菌加入1 mL Extraction Buffer的比例重悬细胞，冰浴超声波破碎5 min（功率20%或200W，超声3 s，间隔7s，重复30次），然后4℃，8,000 g离心10 min，取上清待测。
3.血清或其他液体样本：直接检测。
注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到460 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2.工作液的配制：临用前将Extraction Buffer、Substrate、H2O2按照每孔139 μL：50 μL：1 μL的比例混匀（按需要检测的样本数量进行计算，可多配一些以防不够）；在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热10 min以上；现配现用。
3.在96孔板或微量玻璃比色皿中加入10 μL样本和190 μL工作液，混匀，记录460 nm下0 min时吸光值A1和1 min后的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果加入工作液以后颜色立刻变得较深，可将样本用提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数，植物样本通常稀释5倍比较适宜。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
A.使用96孔板测定的计算公式
1.按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A460变化0.005为一个酶活力单位。
POD(U/g 鲜重)＝ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.005÷T=4,000×ΔA÷W
2.按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A460变化0.005为一个酶活力单位。
POD(U/mg prot)＝ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.005÷T=4,000×ΔA÷Cpr
3.按细菌或细胞样本密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A460变化0.005为一个酶活力单位。
POD(U/104)＝ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T=8×ΔA
4.按液体样本体积计算
单位的定义：每 1 mL液体样本在每mL反应体系中每分钟 A460变化0.005为一个酶活力单位。
POD(U/mL)＝ΔA×V反总÷V样÷0.005÷T=4,000×ΔA
B.使用微量玻璃比色皿测定的计算公式
1.按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A460变化0.01为一个酶活力单位。
POD(U/g 鲜重)＝ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.01÷T=2,000×ΔA÷W
2.按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A460变化0.01为一个酶活力单位。
POD(U/mg prot)＝ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.01÷T=2,000×ΔA÷Cpr
3.按细菌或细胞样本密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A460变化0.01为一个酶活力单位。
POD(U/104)＝ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T=4×ΔA
4.按液体样本体积计算
单位的定义：每 1 mL液体样本在每mL反应体系中每分钟 A460变化0.01为一个酶活力单位。
POD(U/mL)＝ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=2,000×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.2 mL；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；W：样品质量，g；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或细胞总数，500万。
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