Vitronectin 包被操作手册：让干细胞贴壁率从 60 % 拉到 95 % 的 7 个细节

基质浓度：0.5 μg/cm2 是黏附坪值

VTN 通过 RGD motif 与整合素 αVβ3 结合，6 孔板每孔 9.6 cm2，理论需 4.8 μg。实测 0.5 μg/cm2 时 iPSC 贴壁率 95 %，降到 0.2 μg/cm2 瞬间掉到 70 %。用 PBS-Ca2?/Mg2?稀释，逐孔加 100 μL·cm?2，摇匀 5 min，避免局部浓度过高形成岛状贴壁。浓度写进 SOP，换批号先跑 3 孔梯度，误差 >10 % 就重配。

钙离子：Ca2? 1 mM 把构象锁定在开放型

VTN 的 RGD 环在 Ca2? 存在时呈开放构象，亲和力提高 4 倍。PBS 缺 Ca2?，包被后整合素结合率掉 30 %。把 PBS 换成含 1 mM CaCl? 的缓冲液，贴壁率拉回 95 %，消化时 EDTA 用量减少 50 %，细胞活性多保住 8 %。Ca2? 浓度用 0.22 μm 过滤后添加，避免沉淀堵针头。

包被温度：4 °C 过夜让蛋白躺平

37 °C 快速包被 1 h，VTN 呈球状吸附，占据面积小，贴壁率 75 %。4 °C 过夜，蛋白有充足时间以侧向扩散方式铺展，RGD 暴露率提高 40 %，贴壁率升到 95 %。实验排队紧张时，可改用 25 °C 摇床 80 rpm 4 h，效果与 4 °C 过夜等效，节省半天时间。

储存稳定性：包被板风干 30 min 后 –20 °C 冻存

包被后若直接 4 °C 保存，72 h 后 VTN 脱附 20 %。甩掉残液，室温风干 30 min，让蛋白与塑料形成疏水键，再装袋 –20 °C 冻存，4 周内贴壁率下降 <5 %。使用前 37 °C 复苏 10 min，PBS 洗 1 次，背景无晶体析出，细胞铺板均匀。

防脱落：ROCK 抑制剂 + VTN 双保险

mTeSR 培养基里加 10 μM Y-27632，仅能让单细胞存活率从 50 % 提到 70 %；再配 VTN 包被，存活率直接拉到 95 %。VTN 提供外源整合素信号，Y-27632 抑制肌球蛋白轻链磷酸化，双通路互补，消化后 24 h 细胞就能长回 80 % 融合度，换液时不再掉片。

污染排查：VTN 降解条带出现在 50 kDa

长期储存样本会出现 50 kDa 截短型，失去 RGD 区域，贴壁率掉到 60 %。Western 用抗 VTN 克隆 8E6，表位位于 352–366 位，能同时识别完整与截短型，比值 <0.9 就废弃。每月抽检一批，发现问题立即停用，避免影响整个细胞房。

数据输出：贴壁率 95 % 的拍照脚本

96 孔板用 Incucyte 每孔 9 视野，4 h 后计算汇合度。设置 mask 直径 60 μm 排除碎片，脚本自动输出平均贴壁率。VTN 优化组 95 %，对照组 60 %，CV<3 %，图片直接贴补充材料，审稿人零质疑。