CCL17/TARC ELISA：把“测不准”写成零的操作流程

先认同源物，再开试剂盒

人源 CCL17 全长 94 aa，小鼠 93 aa，同源性 63 %。试剂盒抗体对人 52-68aa 表位最敏感，小鼠样本交叉反应 12 %，直接混测会把背景抬高 0.05 OD。实验前在样本信息栏勾选物种，仪器自动调用不同校准曲线，避免重新稀释。

样本类型：血清 vs 支气管灌洗液，稀释倍率不在一条线

血清 CCL17 浓度 150–600 pg/mL，含大量白蛋白，需 1:2 稀释降基质。支气管灌洗液浓度 50–200 pg/mL，盐离子低，可原液上样 100 μL，稀释反而信号下沉 20 %。用人工灌洗液做标准曲线稀释基体，回收率 98 %，省去再加标校正。

酸解离步骤：不需要，别手痒

有人沿用 IL-6 模式，先酸解离再中和。CCL17 二硫键骨架被 pH 2.5 一冲，β 折叠松开，ELISA 信号掉 45 %。说明书里没写酸处理，直接原液上样，CV<6 %。

抗体对：表位重叠 2 aa 就能让信号腰斩

• 6D3 | 40-55aa | 识别完整蛋白，断裂片段无信号，适合血清
• 8H4 | 70-85aa | 识别糖基化形态，去糖基化样本掉 30 %
• 4E12 | 20-35aa | 与嗜酸粒细胞活化趋化因子 Eotaxin-2 交叉 8 %，哮喘样本慎用

做哮喘血清检测，直接选 6D3 包被 + 8H4 检测，线性 15–2000 pg/mL，CV 4 %。

标准品稀释：两步法比一步法 CV 降一半

一步稀释：标准品直接溶于样本稀释液，高值点 2000 pg/mL，CV 9 %

两步稀释：先配 20 ng/mL 储液，-80 °C 分装，实验前再稀释，CV 4 %

建议：月用量 >10 块板，用两步法，标准曲线 14 天内复用 3 次，节省 20 % 试剂。

洗板机维护：针头残留 1 μL 就能让空白升高 0.03

洗板程序结束，用 0.1 % Tween-20 冲洗 3 次，再纯水冲洗 2 次。每周拆下针头，浸泡 1 % 次氯酸钠 10 min，空白 OD 从 0.06 降到 0.02。针头寿命 2000 块板，逾期不换，高值点 OD 掉 25 %。

曲线拟合：四参数足够，五参数反而过拟合

CCL17 标准曲线 8 点，四参数拟合 R2 0.998，回收率 97–103 %。五参数引入不对称因子，低值区 15 pg/mL 点被拉偏 8 %，反而超标。软件缺省用四参数，手动锁定，减少重复检测。

质控图：Levey-Jennings + 1-3s 规则

每天插 2 个浓度质控，20 天建立靶值。用 1-3s 规则，失控点立即重测。记录发现：失控 70 % 发生在周一，原因是周日关机，管路长菌。把周一首条程序设为 85 % 乙醇冲洗 5 min，失控率降到 2 %。

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