Von Willebrand Factor 工作原理剖面：把血小板拴住、胶原锚定、剪切力感知三件事一次说清

250 kDa 的多聚体蛋白，血管破了 0.1 秒，它就先冲上去拉“止血拉链”。

1. 结构模块：A1-A2-A3 是功能三件套

• A1 结构域结合血小板 GPIbα，KD≈1 μM，流速越高结合越快，这是高剪切力下仍能快速 tether 的核心。
• A3 结构域识别胶原Ⅰ/Ⅲ/Ⅵ，KD≈0.3 μM，血管破损后胶原裸露，VWF 先锚定再展臂，给血小板停靠造码头。
• A2 结构域藏着 ADAMTS13 切割位点，流体剪切力 30 dyn/cm2 以上暴露 Tyr1605-Met1606 peptide bond，被酶切后防止血栓过度生长。

2. 多聚体长度：血小板 tether 效率的指数放大器

• 二聚体 VWF 对 GPIbα 亲和力接近 0，八聚体以上开始出现“拉链式”稳定结合，>50 聚体 tether 寿命从 0.01 s 升到 10 s。
• 实验室用 琼脂糖凝胶过滤+SDS-agarose 把多聚体分成 <10、10-50、>50 三档，>50 聚体在 100 dyn/cm2 剪切下捕获效率 95 %，做微流控芯片先选这档。

3. 剪切力阈值：10 dyn/cm2 以下几乎不展臂

• 静态或低剪切（<5 dyn/cm2）VWF 呈球状，直径 50 nm，GPIbα 结合面被隐藏；
• 剪切力升到 10 dyn/cm2，VWF 瞬间伸长成 1 μm 线状，A1 结构域暴露，血小板 tether 数量指数上升。
• 微流控通道设计 20 dyn/cm2 最常用，既能模拟小动脉，又能让 VWF 功能全开，成像背景低。

4. 血小板拴流程：滚动-激活-牢固黏附三步曲

• 第一步：GPIbα-A1 快速结合，滚动速度 10 μm/s，持续 0.1-0.5 s；
• 第二步：滚动触发 Ca2? 内流，整合素 αIIbβ3 激活，纤维蛋白原桥接相邻血小板；
• 第三步：αIIbβ3 与 VWF C4 结构域牢固结合，血小板停止滚动，铺展面积 30 s 内翻倍，形成稳定血栓塞。

5. ADAMTS13 剪刀：防止止血变血栓

• 高剪切下 A2 结构域被拉直，ADAMTS13 切割速率提升 100 倍，产物为 176 kDa/140 kDa 两条带，可用 SDS-agarose 电泳实时观察。
• 缺失 ADAMTS13 的血浆，VWF 多聚体>100 聚体堆积，微流道内血小板栓塞长度增加 5 倍，是 TTP 模型核心表型。

6. 钙离子角色：0.5 mM 即可触发构象变化

• 无钙条件下 VWF 球状构象稳定，A1 与胶原结合面背向；加入 0.5 mM Ca2?，VWF 直径缩小 15 %，A3 胶原亲和力提升 3 倍。
• 实验用 PBS+0.5 mM Ca2? 灌流，胶原包被底物用量可从 50 μg/ml 降到 10 μg/ml，省 80 % 耗材。

7. 实时成像：荧光标记度 1:1 最稳

• Alexa 488-NHS 标记 Lys 残基，标记度 1.0 时多聚体形态不变，血小板 tether 效率与未标记平行；标记度 >2 出现 20 % 抑制。
• 标记后过 Superose 6 去除游离染料，4 °C 避光 48 h 内用完，微流道高剪切成像信背比维持 15:1。