CCL4/MIP-1β 工作原理剖面：从受体结合到细胞迁移动态全链解析

8.6 kDa 的 β-趋化因子，一条 CCR5 轴把单核细胞、NK 细胞、记忆 T 细胞串成一条定向迁移链，漏看任何一环，Transwell 就只剩随机扩散。

1. 溶液构象：三聚体是活性起点

• 生理盐浓度下 CCL4 以 3-10 μM 范围快速形成同源三聚体，CCR5 结合面横跨两条相邻单体，形成“V”形沟。
• 单体形式对 CCR5 亲和力 KD≈200 nM，三聚体直接降到 5 nM，跨膜信号触发阈值从 500 ng/ml 压到 20 ng/ml，实验预算瞬间砍 25 倍。

2. 受体选择：CCR1 与 CCR5 双轴并行

• CCR5 是主要介导者，表达在 CD3?CD45RO? T 细胞与 CD56dim NK 亚群；CCR1 只在 CD14? 单核细胞高表达。
• 10 ng/ml CCL4 对 CCR5 已饱和，对 CCR1 仅 30 % 占位，做 THP-1 迁移用 50 ng/ml 足够，做原代 NK 降到 10 ng/ml 避免 CCR1 轴背景。

3. G 蛋白循环：Gi 抑制 = 迁移刹车

• CCL4-CCR5 复合体激活 Gi2α，cAMP 瞬降 60 %，PKA 底物磷酸化水平同步下降，细胞前端形成 Rac1-GTP 极化冠。
• 加入 100 ng/ml PTX 完全阻断，迁移率从 35 % 掉到 3 %，用来确认信号特异性，比抗体阻断便宜 80 %。

4. 脂筏定位：胆固醇耗竭让信号熄火

• 甲基-β-环糊精 5 mM 处理 15 min，CCR5 脂筏驻留率从 72 % 降到 18 %，CCL4 刺激后 ERK 磷酸化峰值减半。
• restores cholesterol by 0.5 mM water-soluble cholesterol，信号全部回弹，说明膜序对趋化敏感，做原代细胞最好保持 10 % FBS 维持脂筏稳态。

5. 梯度建立：30 min 内稳定，60 min 开始崩

• Transwell 下室 200 μl，上室 100 μl，5 μm 孔径，37 °C 下 CCL4 扩散系数 D≈0.8×10?? cm2/s，30 min 时上室浓度达到下室 35 %，形成有效梯度。
• 超过 60 min 上下室浓度差 < 10 %，细胞失去方向感，迁移数进入平台，采集时间严格卡在 90 min 以内，数据才呈线性。

6. 内源释放：LPS 刺激巨噬细胞 4 h 峰值

• 1 μg/ml LPS 刺激 RAW264.7，上清 CCL4 在 4 h 达到 1.2 ng/ml，8 h 降到 0.3 ng/ml，提前收取可省去购买重组蛋白费用。
• 上清需过 10 kDa 超滤管浓缩 10 倍，再经 0.22 μm 过滤，蛋白含量用 AMC 荧光底物法标定，误差 < 8 %，适合预算有限的课题。

7. 实时监测：荧光标记维持 1:1 标记度

• Alexa Fluor 488 C5-马来酰亚胺标记 Cys11，标记度 1.2 时，CCR5 结合 KD 几乎不变；标记度 > 2 形成双标，KD 升到 45 nM，迁移率掉 40 %。
• 标记后立刻加 2 mM DTT 淬灭游离染料，过 HiTrap Desalt 去除，标记蛋白 4 °C 避光保存 72 h 内用完，可实时观察梯度形成与细胞追踪。