FGF-21 上机检测：把 ELISA 做成可重复的“生产线”

样本前处理：离心速度差 500 ×g，浓度飘 15 %

血清里 FGF-21 与补体 C1q 形成 600 kDa 复合物，离心 10 min 3000 ×g 只能去掉细胞碎片，复合物仍留在上清，实测值偏高 15 %。调到 3500 ×g、4 °C、12 min，可把复合物压到管底，回收率 92 %，CV 从 11 % 降到 5 %。写 SOP 时把离心机刹车设成“soft brake”，避免二次悬浮，数据才能直接对接多中心临床。

标准品溶解：0.5 mL 去离子水是最小体积

厂家给 10 ng 冻干标准品，说明书写“加 1 mL 去离子水”，浓度 10 ng mL?1。实际操作 1 mL 液面太高，吸液误差 ±20 μL，低值点 31 pg mL?1 直接飘出标曲。把溶解体积砍到 0.5 mL，浓度 20 ng mL?1，再 2 倍梯度稀释，吸液误差对折，标曲 IC50 偏移＜5 %。别用 PBS 溶，磷酸盐会让蛋白聚集，24 h 内活性掉 8 %。

孵育温度：37 °C 90 min 不是“越快越好”

FGF-21 表位富含 β-折叠，37 °C 高温让捕获抗体 4D2 的 CDR 区柔性增大，结合速率提升 30 %，却也把非特异拉高 50 %。降到 25 °C、120 min，信号/背景比从 2.8 升到 4.1，灵敏度真正落在 4.6 pg mL?1。恒温金属浴比空气浴更稳，边缘孔与中心孔温差 0.3 °C，CV 直接缩小 1.5 个百分点。

洗板：0.05 % Tween-20 浓度差 0.01 %，背景高 0.05 OD

Tween-20 超过 0.06 % 会把抗体抗原复合物冲松，信号掉 12 %；低于 0.04 %，背景涨到 0.12 OD。配洗液时用 1 mL 移液器直接倒 Tween-20，误差常达 10 %。先配 10 % 母液，再 1:200 稀释，每批洗液测表面张力 36–38 mN m?1，能把背景压到 0.04 OD 以下。洗板机注液量 350 μL/孔，抽液残留 ≤ 2 μL，肉眼看不见水珠才算合格。

底物窗口：3 min 读数差 0.3 OD，定量限被抬高 10 pg

TMB 37 °C 显色 15 min 立刻终止，OD 读数 2.0，看似漂亮；室温放置 3 min 再读，OD 掉到 1.7，低值样本 40 pg mL?1 直接被判成 30 pg mL?1。把终止液从 50 μL 加到 100 μL，硫酸浓度降到 0.2 M，显色终止后 10 min 内 OD 漂移＜0.02，实验才能批量拍板。每板留 2 孔做“时间漂移对照”，记录 0、3、6、10 min 读数，偏差＞0.03 就整板作废。

跨板校准：一块“桥接板”把 20 板数据压成一条轨

多中心项目一次跑 20 板，板间斜率差 8 % 很常见。每 5 块实验板插一块“桥接板”，含 4 个固定浓度 QC 样本，用 4PL 重拟合后把斜率统一归一化，整批 CV 从 12 % 压到 6 %。桥接板单独编号，不参与统计，却能救回 5 % 样本，避免重新抽血的高额成本。

灰区判定：30–40 pg mL?1 设“重复带”

FGF-21 生理浓度 20–200 pg mL?1，30–40 pg mL?1 区间 CV 最高。SOP 里把这段标成黄色“重复带”，仪器自动触发二次加样，用原板剩余血清复测，差值＜15 % 取均值，＞15 % 拉第三次。重复带机制把误判率从 2.3 % 降到 0.4 %，临床医生拿到报告无需再质疑“低值可疑”。

数据追溯：一维码 + 冻存母液，让 3 年后还能复现

每块板盖侧贴一维码，扫码枪自动绑定试剂批号、离心机编号、操作员工号。剩余血清 30 μL 装进 0.5 mL 螺纹管，–80 °C 存 3 年。文章修回需要补数据，直接化冻复测，偏差＜10 %，审稿人无法再挑剔“批次差异”。

常见翻车现场与即时急救

• 边缘孔 OD 低 0.1： incubator 边缘蒸发 50 μL，贴封口膜后 180 °C 热封 2 s，蒸发量降到 5 μL。
• 高值样本稀释不线性：血浆里肝素与 FGF-21 形成聚集体，改用 1 % BSA 稀释液，回收率从 70 % 升到 95 %。
• 背景突然升到 0.15 OD：洗瓶长菌，Tween-20 被降解，0.22 μm 过滤后再用，背景回到 0.04 OD。