小鼠白介素-17 ELISA 操作使用实战：把 CTLA8 信号一次做准的落地 SOP

01 样本动线：血清→离心→酸解→中和，四步锁死活性

IL-17 半衰期 2–3 h，室温放置 1 h 损失 15 %。

采血后 30 min 内 1 500 g 离心 10 min，上层血清转移到 0.5 mL 低吸附管，立即冰浴。

酸性环境抑制蛋白水解：加 1 M 甘氨酸-HCl pH 3.0 体积比 1:10，10 min 后加 1 M Tris-HCl pH 11.0 回中和，IL-17 回收率 98 %，背景 OD 不升高。

02 稀释逻辑：1:5 与 1:50 两条预实验决定正式梯度

小鼠胶原关节炎血清 IL-17 范围 30–3 000 pg/mL。

先做 1:5 与 1:50 两条预实验，确定高值样本落在 1 000–2 000 pg/mL，低值样本落在 50–200 pg/mL。

正式实验用 1:10 单一稀释，回收率 95 %–105 %，省掉多条稀释线，96 孔板一次跑完。

03 洗板节奏：350 μL/孔→浸泡 30 s→三阶脉冲，残留体积 < 2 μL

洗板机设定：

• 注入速度 9 档，350 μL/孔
• 浸泡 30 s
• 三阶脉冲抽吸，负压 ?60 kPa

残留体积 1.8 μL，背景 OD 稳在 0.025，比常规快冲模式降 0.008。

每天首板用酚红法验证，492 nm OD ≤ 0.02 才算通过，记录贴在洗板机侧门。

04 显色窗口：TMB 8 min 终止，线性段最长

TMB 显色动力学：0–8 min OD 与 IL-17 浓度线性斜率 0.0025 ΔOD·pg?1·mL，8 min 后进入平台。

设定 8 min 准时加 50 μL 1 M H?PO?，产物 450 nm 稳定 30 min，实验室可批量终止后统一读数。

超时到 12 min，平台高值 OD 降 0.02，需重新标曲，耽误 2 h。

05 读数陷阱：气泡在 450 nm 吸 0.015，630 nm 只吸 0.003

双波长 450/630 nm 扣背景，气泡 450 nm 信号 0.015，630 nm 仅 0.003，差值 0.012 仍算进结果。

终止后 1 000 rpm 轻甩 10 s，气泡破裂，450 nm 信号降 0.01，数据直接合格，省去重复读板。

06 异常值回算：Hook 效应 > 8 000 pg/mL 的假低现象

高值样本 10 000 pg/mL 出现 Hook，实测 OD 掉到 3 000 pg/mL 水平。

预实验加做 1:100 稀释，若稀释后值 ×100 与 1:10 不成线性，即可判定 Hook。

把上限锁定 6 000 pg/mL，超过此值自动报 "> 6 000"，不再稀释，节省样本与工时。

07 数据模板：Excel 一键导入→四参数拟合→CF 校正→报告打印

模板预设：

• 原始 OD→扣除空白
• 四参数拟合→自动算出浓度
• QC 样本生成 CF = 理论值/实测值
• 所有浓度 ×CF