永生化猪巨噬细胞(含成纤维细胞)-MYC：技术参数全景解析

永生化机制：MYC-ER(TAM)诱导系统的时空调控

c-MYC融合雌激素受体突变体（ERTAM）通过4-羟基他莫昔芬（4-OHT）激活，48 h内驱动细胞周期进入S期效率>90%。成纤维细胞额外表达Bcl-xL，抑制MYC诱导的凋亡，维持增殖指数PI>85%。核型分析显示，P10代仍保持38条染色体，未见易位或端粒融合。

倍增曲线：巨噬细胞与成纤维细胞的分化节奏

RPMI-1640+10% FBS+1 μg/mL 4-OHT条件下：

• 巨噬细胞群体倍增时间（PDT）22–26 h，第6天进入平台期（密度2.5×10? cells/cm2）。
• 成纤维细胞PDT 16–18 h，第5天密度可达4.0×10? cells/cm2。

撤除4-OHT 72 h后，巨噬细胞CD163表达恢复至原代水平，成纤维细胞胶原分泌量下降60%，验证MYC可逆性。

基因编辑窗口：CRISPR-Cas9的最佳MOI

慢病毒递送SpCas9-2A-GFP，MOI 3时感染效率>95%，编辑效率在巨噬细胞达72%，成纤维细胞达85%。嘌呤霉素筛选浓度：巨噬细胞1.5 μg/mL，成纤维细胞2.0 μg/mL；筛选72 h即可富集>98%阳性群。

表型验证：流式抗体组合与门控策略

巨噬细胞：CD14-FITC(1:100)/CD172a-PE(1:80)/MHC II-APC(1:50)，门控FSC-A/SSC-A去碎片→单细胞→CD14?/CD172a?。

成纤维细胞：Vimentin-FITC(1:200)/CD90-PE(1:100)/Collagen I-APC(1:50)，门控FSC-A/SSC-A→Vimentin?/CD90?。

批次CV值<5%视为合格。

无菌与病毒安全：双重qPCR阈值

每批次放行检测：

• 细菌16S rRNA <10 copies/mL；
• 真菌ITS <10 copies/mL；
• 支原体<5 copies/mL；
• 猪内源性逆转录病毒（PERV）pol基因<50 copies/mL。

任何一项超标整批销毁。

功能质控：NO与胶原分泌基线

巨噬细胞LPS刺激后NO产量≥15 μM/10? cells/24 h；成纤维细胞TGF-β1刺激后胶原I分泌≥25 μg/10? cells/48 h。偏离±20%即判定功能漂移。

运输条件：干冰温控曲线

干冰包装重量≥2 kg，箱内温度-78±2℃，72 h内到达目的地。开箱立即37℃水浴复苏，存活率>90%。延迟>10 min存活率降至<70%。