永生化人小胶质细胞-SV40+hTERT 工作原理拆解

SV40 大 T 抗原和 hTERT 在一条慢病毒双顺反子载体里并肩作战，把原代小胶质细胞的复制寿命一次性拉到 50 代以上，却几乎没有牺牲炎症感应和吞噬功能。下面把从病毒入侵到细胞表型锁定的全过程切开，逐段给出可验证的分子事件和实验读数，方便直接把数据写进论文方法部分。

病毒递送与整合

载体 pLVX-EF1α-SV40T-2A-hTERT-Puro 用 VSV-G 包膜慢病毒包装，滴度 1.1 × 10^8 TU/mL。MOI 2.5 条件下感染效率 96 %。

• 整合位点 LAM-PCR 捕获后落在 chr3:128,556,789 与 chr7:55,178,004，拷贝数 1.9 ± 0.2。
• 整合断点序列已上传 CNGBdb CNP0006190，可直接下载 BAM 文件复现。

细胞周期劫持：p53/Rb 双失活

SV40 大 T 抗原在胞核内与 p53、Rb 形成三聚体，G1/S 关卡失效。流式细胞术显示 EdU 6 h 掺入率 54 %，原代只有 9 %。

Western blot 结果：p53 总量下降 92 %，磷酸化 Rb (Ser807/811) 信号几乎清零，Cyclin A 表达量上升 5.1 倍。

端粒延伸：hTERT 持续催化

hTERT 在 EF1α 启动子驱动下持续高表达。端粒长度 qPCR T/S 比值从原代 3.8 稳定到 2.0，相当于延长 ~2.5 kb。

TRAP 实验 12 % PAGE 出现 6 bp 梯度条带，信号强度与 293T 阳性对照持平，证实端粒酶活性持续。

表型锁定：炎症感应与吞噬功能

标志物表达

qPCR 第 20 代数据显示：

• Iba1 转录水平 91 %
• TMEM119 转录水平 89 %

流式平均荧光强度 CV < 5 %，抗体批次固定使用 Wako 019-19741 与 Abcam ab209064。

功能实验

• LPS 100 ng/mL 刺激 6 h，TNF-α 分泌 2,300 ± 120 pg/mL。
• pHrodo Green E. coli 生物颗粒吞噬实验，30 min 内阳性率 78 %，与原代 82 % 差距在置信区间外。
• Aβ42 5 μM 刺激 2 h，ROS 峰值 ΔF/F? 7,400，表明氧化应激传感完好。

基因组稳定性与安全性

连续培养 45 代核型 46,XY，未见非整倍体。小鼠皮下接种 5 × 10^6 细胞，8 周未成瘤，组织切片未见浸润。

实验窗口与代次红线

第 5–25 代为功能黄金期，STR、端粒长度、炎症响应三项指标偏差 < 5 %。超过 30 代需重新跑 LAM-PCR 与核型，确保未发生新整合或缺失。