永生化大鼠肺微血管内皮细胞-SV40 技术参数

细胞身份与遗传背景

• 原始组织：6–8 周龄 SPF 级 SD 大鼠肺微血管段
• 永生化方式：SV40 大 T 抗原慢病毒载体，CMV 增强子/β-actin 启动子，Puromycin 筛选标记
• 插入位点：Chr 10q32，单拷贝整合，经 FISH 确认无随机多拷贝簇
• 支原体检测：每批次 qPCR 阴性报告，灵敏度 10 CFU/mL

形态与表型

• 光学形态：铺路石样单层，边缘清晰，核大居中
• 透射电镜：Weibel-Palade 小体可见率 85 %
• 流式表型：CD31 98 %、vWF 96 %、VE-cadherin 94 %、α-SMA <2 %

生长动力学

• 倍增时间：18 ± 1 h（P20，完全培养基，37 ℃，5 % CO?）
• 饱和密度：1.2 × 10? cells/cm2
• 传代窗口：70–80 % 汇合度，1:3–1:4 分率，可稳定传 60 代以上

培养基与添加剂

• 基础液：DMEM/F-12（1:1），高糖型
• 血清：10 % FBS（内毒素 ≤ 0.1 EU/mL）
• 补充因子：
  • 50 μg/mL endothelial cell growth supplement
  • 10 ng/mL VEGF-165
  • 1× non-essential amino acids
  • 1 mM sodium pyruvate
  • 1 % penicillin-streptomycin
• 包被：0.2 % gelatin，37 ℃ 包被 30 min，吸干即可

功能验证

• 管腔形成：Matrigel 上 6 h 形成完整网络，节点数 ≥ 30/field（×100）
• 乙酰化 LDL 摄取：Dil-Ac-LDL 10 μg/mL，4 h 荧光阳性率 >90 %
• 屏障功能：Transwell 0.4 μm 膜，TEER 峰值 85 ± 8 Ω·cm2

冻存与复苏

• 冻存液：90 % FBS + 10 % DMSO
• 密度：1 × 10? cells/mL/管
• 程序降温：-1 ℃/min 至 -80 ℃，过夜转液氮
• 复苏存活率：台盼蓝法 ≥ 90 %，24 h 贴壁率 ≥ 95 %

质量控制批放行标准