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永生化小鼠膀胱上皮细胞-hTERT 技术参数全貌
发表时间：2025-08-21细胞身份与基因背景
- 品系来源：8 周龄 C57BL/6J 雄性小鼠膀胱穹隆部上皮
- 永生化方式：慢病毒载体整合 hTERT-P2A-Neo 盒式结构，转录受 CMV 早期增强子/鸡 β-actin 复合启动子驱动
- 插入位点：Chr 7qE3（NCBI 登录号：PRJNA954672），单拷贝插入，无随机多拷贝引起的表达漂移
生长动力学与倍增曲线
- 群体倍增时间：22 ± 1.5 h（P20 代，完全培养基，37 ℃，5 % CO?）
- 饱和密度：4.2 × 10? cells/cm2（T-75 瓶，72 h 不换液）
- 极限传代：>100 代未见衰老相关 β-gal 阳性率 >5 %
培养基与添加剂
- 基础培养基：Keratinocyte-SFM（Gibco 17005042）
-
补充成分：
- 25 μg/mL bovine pituitary extract
- 0.2 ng/mL EGF
- 1× ITS-X (insulin, transferrin, selenium, ethanolamine)
- 0.5 μg/mL hydrocortisone
- 100 U/mL penicillin + 100 μg/mL streptomycin
- 包被基质：0.1 % gelatin 预铺 30 min，室温风干即可
表面标志物谱
| 标志物 | 表达率（流式） | 荧光抗体克隆号 | 备注 |
|---|---|---|---|
| CK18 | 98.2 % | CK2 | 上皮谱系确认 |
| CK5/14 | 1.1 % | AF138 | 基底细胞低表达 |
| Uroplakin II | 92.7 % | AU-1 | 膀胱分化特异 |
| E-cadherin | 96.4 % | 36/E-cadherin | 细胞连接完整 |
| p63 | 3.5 % | 4A4 | 干细胞阴性 |
染色体核型
- 核型：40, XY（>95 % 细胞），hTERT 整合位点 FISH 显示单信号，无大片段缺失
- 微核率：<0.3 %，符合 OECD TG 487 体外遗传毒性标准
功能验证
- 屏障功能：TEER 值 800 ± 50 Ω·cm2（12-well Transwell，0.4 μm 孔径）
- 渗透系数：FITC-dextran 4 kDa P_app = 2.1 × 10?? cm/s
- 诱导炎症：LPS 1 μg/mL 刺激 6 h，IL-6 分泌量 18.7 ng/mL（ELISA）
运输与储存
- 形式：P15 冻存管，1 × 10? cells/mL，含 90 % FBS + 10 % DMSO
- 干冰运输：-78 ℃ 72 h 内签收
- 液氮储存：气相 -150 ℃，理论活性保持 >5 年
质量控制批放行标准
- 无菌检测：14 天培养无细菌、真菌生长
- 支原体 PCR：阴性
- 细胞活性：复苏 24 h 贴壁率 ≥90 %，台盼蓝拒染率 ≥95 %
- 基因稳定性：每 10 代 qPCR 验证 hTERT mRNA 表达量 CV < 5 %
