永生化小鼠 MyD88-/- 肝星状细胞培养操作指南

细胞特性与应用价值

永生化小鼠 MyD88-/- 肝星状细胞是一种经过基因修饰的细胞系，通过敲除 MyD88 基因实现对先天免疫信号通路的阻断。这种细胞系保留了肝星状细胞的生物学功能，如细胞外基质的合成与降解，同时具备无限增殖能力。它在研究肝脏炎症、纤维化以及免疫调节机制中具有重要应用价值，尤其适用于探索 MyD88 信号通路在肝病发展中的作用。

培养基配制

选择适合肝星状细胞生长的基础培养基，如 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 高糖型培养基。向基础培养基中添加以下成分：

• 胎牛血清 (FBS)：添加 10% 胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质和生长因子。
• 青霉素-链霉素溶液 (P/S)：加入 1% 青霉素-链霉素溶液，防止细菌和真菌污染。
• L-谷氨酰胺：添加 2 mM L-谷氨酰胺，满足细胞代谢需求。
• 胰岛素-转铁蛋白-硒 (ITS)：添加 1% ITS 补充剂，提供细胞生长所需的微量元素和激素。

配制好的培养基需在 4℃下保存，避免反复冻融，并在使用前预热至 37℃。

培养条件

• 温度和气体环境：细胞应在 37℃、5% CO? 的培养箱中培养。CO? 的作用是维持培养基的 pH 稳定，培养箱内的湿度应保持在 95% 以上，以防止培养基过度蒸发。
• 培养容器：选择透气性好、无毒且表面经过处理的培养皿或培养瓶。在使用前，用 75% 的酒精对培养容器进行消毒，并在超净工作台内进行操作，降低污染风险。对于一些特殊实验，可能需要使用预先包被有胶原蛋白或纤维连接蛋白的培养皿，以促进细胞的贴壁和生长。

细胞的复苏、传代与冻存

细胞复苏

从液氮罐中取出冻存管，迅速放入 37℃水浴中快速解冻。解冻后用新鲜培养基稀释细胞悬液，轻轻吹打混匀。将细胞悬液转移至培养容器，置于 37℃、5% CO? 培养箱静置培养。复苏初期细胞处于滞后期，生长缓慢，此时保持培养环境稳定，避免频繁操作。24 - 48 小时后细胞进入生长期，开始正常增殖。

细胞传代

细胞生长至培养容器表面的 80% - 90% 汇合度时进行传代。用 PBS 洗涤细胞 2 - 3 次，加入 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 溶液，37℃ 酵 1 - 2 分钟，显微镜下观察细胞脱落情况，避免过度消化。加入含血清培养基终止消化，吹打制成均匀细胞悬液。按 1:2 或 1:3 比例分装至新培养容器，加入新鲜培养基继续培养。

细胞冻存

长期保存时进行细胞冻存。冻存液配方为含 10% DMSO 的胎牛血清，DMSO 作冷冻保护剂减少冰晶损伤。用胰蛋白酶消化细胞制成悬液，收集离心后用冻存液重悬，调整细胞密度至 5×10? - 1×10? cells/ml。分装至冻存管，放入程序降温盒，-80℃ 过夜后转移至液氮罐保存。

常见问题及解决方案

细胞污染

污染来源多样，预防措施包括无菌操作、定期消毒培养环境与试剂、使用高质量培养基与试剂。污染发生时立即停止培养处理。

细胞生长缓慢

可能因培养基营养不足、细胞密度过高或过低、培养环境不稳定导致。需检查培养基质量、调整细胞密度、稳定培养环境。

细胞形态异常

或与消化过度、培养环境变化相关，优化消化时间、稳定培养条件可解决。