永生化16三体小鼠神经元细胞(MTh)培养操作指南

永生化16三体小鼠神经元细胞(MTh)是研究神经发育、疾病机制与药物筛选的宝贵模型。本文聚焦于MTh细胞的培养操作，旨在为科研人员提供实用、高效的培养技术指导。

一、培养基配制

基础培养基选用Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)，富含必要营养成分。向DMEM中添加10%胎牛血清(FBS)，提供细胞生长所需营养与生长因子；加入1%青霉素-链霉素溶液(P/S)，防止细菌真菌污染；添加0.1 mM β-巯基乙醇，维持细胞还原环境；补充2 mM L-谷氨酰胺，满足细胞代谢需求。配制完成的培养基4℃保存备用。

二、培养条件

MTh细胞在37℃、5% CO?培养箱中培养，湿度保持95%以上，确保培养基稳定与细胞正常生长。培养容器选择透气无毒且表面经处理的培养皿或培养瓶，部分实验需用聚-D-赖氨酸或层粘连蛋白包被培养皿，促进细胞贴壁生长。

三、细胞复苏

从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37℃水浴快速解冻。解冻后用新鲜培养基稀释细胞悬液，轻轻吹打混匀。将细胞悬液转移至培养容器，置于37℃、5% CO?培养箱静置培养。复苏初期细胞处于滞后期，生长缓慢，此时保持培养环境稳定，避免频繁操作。24 - 48小时后细胞进入生长期，开始正常增殖。

四、细胞传代

细胞生长至培养容器表面80% - 90%汇合时进行传代。先用PBS洗涤细胞2 - 3次，去除血清成分。加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液，37℃孵育1 - 2分钟，显微镜下观察细胞脱落情况，避免过度消化。加入含血清培养基终止消化，吹打制成均匀细胞悬液。按1:2至1:3比例分装至新培养容器，加入新鲜培养基继续培养。

五、细胞冻存

长期保存时进行细胞冻存。冻存液配方为含10%DMSO的胎牛血清，DMSO作冷冻保护剂减少冰晶损伤。用胰蛋白酶消化细胞制成悬液，收集离心后用冻存液重悬，调整细胞密度至5×10? - 1×10? cells/ml。分装至冻存管，放入程序降温盒，-80℃过夜后转移至液氮罐保存。

六、常见问题及解决方案

细胞污染是培养常见问题，来源多样，预防措施包括无菌操作、定期消毒培养环境与试剂、使用高质量培养基与试剂。污染发生时立即停止培养处理。细胞生长缓慢可能因培养基营养不足、细胞密度不合理、培养环境不稳定导致，需检查培养基质量、调整细胞密度、稳定培养环境。细胞形态异常或与消化过度、培养环境变化相关，优化消化时间、稳定培养条件可解决。