永生化小鼠系膜细胞 - SV40 的培养操作指南

一、细胞简介

永生化小鼠系膜细胞 - SV40 是一种经过 SV40 病毒大 T 抗原转化的细胞系。这种细胞系具有无限增殖的能力，同时保留了系膜细胞的一些特性。SV40 病毒通过整合到宿主细胞基因组中，使细胞绕过正常的衰老和凋亡机制，实现永生化。这对于细胞生物学研究、疾病模型建立以及药物筛选等领域具有重要价值。

二、培养前的准备

（一）培养基的配制

选择合适的培养基是细胞培养成功的关键。对于永生化小鼠系膜细胞 - SV40，通常使用 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基。在配制培养基时，需要添加 10% 胎牛血清（FBS），以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子。此外，还可以添加 1% 的青霉素 - 链霉素溶液，以防止细菌和真菌的污染。所有试剂应确保新鲜且无菌，避免因试剂质量问题影响细胞的生长。

（二）培养容器的选择与处理

细胞培养容器应选择透气性好、无毒且表面经过处理的培养皿或培养瓶。在使用前，需用 75% 的酒精对培养容器进行消毒，并在超净工作台内进行操作，以降低污染的风险。对于一些特殊实验，可能需要使用特定的培养表面，如包被有胶原蛋白或纤维连接蛋白的培养皿，以促进细胞的贴壁和生长。

（三）细胞的复苏

从液氮中复苏细胞时，应迅速将细胞从液氮罐中取出，放入 37℃水浴中快速解冻。解冻后的细胞应立即用新鲜的培养基进行稀释，并轻轻吹打混匀。然后将细胞悬液转移到培养容器中，置于 37℃、5% CO?的培养箱中静置培养。在复苏后的前 24 小时内，避免对细胞进行频繁的操作，以让细胞有足够的时间恢复活力。

三、细胞培养的操作流程

（一）细胞的接种

根据实验需求，确定合适的细胞接种密度。一般来说，永生化小鼠系膜细胞 - SV40 的接种密度可在 5×103 - 1×10? cells/cm2 之间。将细胞悬液均匀地接种到培养容器中，确保细胞分布均匀，避免局部细胞密度过高或过低。接种后，轻轻晃动培养容器，使细胞与培养表面充分接触，有利于细胞的贴壁。

（二）原代培养

在原代培养阶段，细胞需要适应新的培养环境。将接种好的培养容器放入 37℃、5% CO?的培养箱中培养。培养初期，细胞可能会经历一个滞后期，生长速度较慢。此时应保持培养环境的稳定，避免频繁扰动细胞。定期观察细胞的生长状态，如细胞的形态、颜色以及是否有污染迹象等。一般在培养 24 - 48 小时后，细胞会逐渐进入生长期，开始增殖。

（三）细胞的传代

当细胞生长至培养容器表面的 80% - 90% 汇合时，即可进行传代操作。首先，用无菌的 PBS 洗涤细胞 2 - 3 次，以去除培养基中的血清成分。然后加入适量的 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 溶液，在 37℃下孵育 1 - 2 分钟，使细胞从培养表面脱落。在显微镜下观察细胞的脱落情况，避免过度消化导致细胞损伤。随后，加入含血清的培养基终止消化，用吸管轻轻吹打细胞，制成均匀的细胞悬液。按照 1:2 - 1:3 的比例将细胞悬液分装到新的培养容器中，加入新鲜的培养基，继续培养。

（四）细胞的冻存

对于长期保存的需要，可将细胞进行冻存。在冻存前，确保细胞处于良好的生长状态，无污染。用胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，然后按照 5×10? - 1×10? cells/ml 的浓度将细胞悬液与冻存液（一般含 10% DMSO 的 FBS）混合。将混合好的细胞悬液分装到冻存管中，每个冻存管装 1 - 1.5 ml。然后将冻存管放入程序降温盒中，放入 - 80℃冰箱过夜。第二天，将冻存管转移到液氮罐中长期保存。冻存过程中，应尽量减少温度变化对细胞的冲击，以提高细胞的复苏率。

四、常见问题及解决方案

（一）细胞污染

细胞污染是细胞培养过程中常见的问题之一。污染物可能来源于培养基、试剂、培养容器以及操作过程中的空气等。一旦发现细胞受到细菌、真菌或支原体等污染，应立即停止培养，并对污染的细胞进行处理。对于轻度污染的细胞，可以尝试使用抗生素或抗真菌药物进行治疗，但这种方法可能会对细胞产生一定的毒性作用，影响细胞的正常生长。因此，在细胞培养过程中，应严格遵守无菌操作原则，定期对培养环境和试剂进行消毒处理，以预防细胞污染的发生。

（二）细胞生长缓慢

细胞生长缓慢可能由多种因素引起，如培养基的营养成分不足、细胞密度过高或过低、培养环境不稳定等。首先，应检查培养基的质量，确保其成分新鲜、无污染且符合细胞生长的要求。如果培养基存在问题，应及时更换。其次，调整细胞的接种密度，使其处于适宜的范围内。此外，保持培养环境的稳定，如温度、CO?浓度等，对细胞的生长也至关重要。定期观察细胞的生长状态，及时发现问题并采取相应的措施进行调整。

（三）细胞形态异常

细胞形态异常可能提示细胞的生理状态发生了变化，如细胞受到应激、损伤或发生了恶性转化等。导致细胞形态异常的原因有很多，包括培养条件的改变、细胞传代次数过多、病毒感染等。在细胞培养过程中，应密切观察细胞的形态变化。如果发现细胞形态异常，应首先检查培养条件是否符合要求，如温度、CO?浓度、培养基成分等。同时，回顾细胞的传代历史，确保传代次数在合理范围内。对于受到病毒感染的细胞，应及时进行隔离和处理，防止病毒扩散到其他细胞培养体系中。