永生化人表皮角质形成细胞的操作使用

细胞复苏操作

• 准备培养基和耗材 ：提前准备好适合永生化人表皮角质形成细胞生长的培养基，如含有 5-10v/v% 胎牛血清、10-100IU/ml 青霉素、10-100μg/ml 链霉素的高糖 DMEM 培养基等，同时准备好 PriCoat?ECM T25 培养瓶或 Applied Cell 细胞外基质涂层的培养瓶。
• 取出冻存细胞 ：从液氮罐或 - 130°C 以下的保存环境中取出冻存的永生化人表皮角质形成细胞，迅速放入 37°C 水浴中快速解冻，轻轻摇晃使其均匀受热，直到冻存管内的干冰完全溶解。
• 细胞处理与培养 ：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，加入适量的培养基轻轻吹打混匀，然后进行离心，去除冻存液。再用新鲜培养基重悬细胞，将其接种到预先准备好的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞均匀分布，放入 37.0°C、5% CO? 的培养箱中进行培养。

细胞传代操作

• 观察细胞状态 ：在倒置显微镜下观察细胞的生长状态和密度，当细胞生长至培养瓶壁的 80%-90% 时，即可进行传代操作。
• 细胞消化与收集 ：弃去培养瓶中的旧培养基，加入适量的 PBS 清洗细胞，去除残留的培养基和杂质。加入胰蛋白酶消化液，在 37°C 下孵育 1-2 分钟，观察细胞是否从瓶壁脱落。当细胞大部分脱落后，加入含血清的培养基终止消化，用吸管轻轻吹打细胞，使其分散成单个细胞或小细胞团，然后将细胞悬液转移至离心管中，进行离心收集细胞。
• 细胞计数与接种 ：对离心后的细胞进行计数，根据需要的传代比例，将细胞悬液按适当的比例接种到新的培养瓶中，加入新鲜的培养基，轻轻摇晃培养瓶使细胞均匀分布，放入培养箱中继续培养。

细胞冻存操作

• 准备冻存液和冻存管 ：冻存液一般由基础培养基、胎牛血清和 DMSO 按一定比例配制而成，如含 90% 胎牛血清和 10% DMSO 的冻存液。准备好标记好细胞名称、冻存日期等信息的冻存管。
• 细胞收集与处理 ：将培养好的永生化人表皮角质形成细胞用胰蛋白酶消化并收集，离心去除培养基和消化液，用冻存液重悬细胞，调整细胞密度至适当浓度，一般为 1×10^6 cells/ml 左右。
• 细胞分装与冻存 ：将细胞悬液分装到冻存管中，每管 1-2ml。将冻存管放入 - 80°C 冰箱中预冻 2-4 小时，然后转移到液氮罐中长期保存。在冻存过程中，要尽量保持温度的均匀下降，以减少细胞内冰晶的形成对细胞的损伤。