永生化人新生成纤维细胞的操作使用指南

一、细胞培养概述

永生化人新生成纤维细胞是一种重要的细胞模型，广泛应用于皮肤生物学、组织工程以及药物筛选等研究领域。

二、培养基的配制与选择

2.1 培养基成分

常用的培养基为高糖 DMEM，添加以下成分：

• 15% 胎牛血清（FBS）：提供丰富的营养和生长因子。
• 1% L - 谷氨酰胺：维持细胞代谢和 pH 值稳定。
• 1% 青霉素 / 链霉素溶液：防止微生物污染。
• 0.75 μg/ml 嘌呤霉素：用于筛选和维持稳定的细胞系。

2.2 培养条件

• 温度：37℃
• 气体环境：5% CO?、95% 空气
• 湿度：70%-80%。

三、细胞的复苏与冻存

3.1 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管，迅速放入 37℃水浴中快速解冻，约 1 分钟左右。
2. 将冻存管中的细胞悬液转移至离心管，加入适量培养基稀释。
3. 以 1000rpm 的速度离心 5 分钟，去除上清。
4. 用新鲜培养基重悬细胞，转移至培养瓶中，轻轻晃动培养瓶使细胞均匀分布。
5. 将培养瓶放入 37℃、5% CO? 的培养箱中培养。

3.2 细胞冻存

1. 选择处于对数生长期的细胞进行冻存。
2. 用胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液。
3. 取适量细胞悬液，加入含 10% DMSO 的冻存液中，轻轻混匀。
4. 将混合后的细胞悬液分装于冻存管中，每管约 1ml。
5. 将冻存管放入 - 80℃冰箱中预冻 2 - 4 小时，然后转移至液氮罐中长期保存。

四、细胞的传代

4.1 传代时机

当细胞生长至培养瓶壁的 80% - 90% 汇合时，即可进行传代。

4.2 传代步骤

1. 吸去培养瓶中的上清液，用 PBS 润洗细胞 1 - 2 次。
2. 加入适量 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液均匀覆盖细胞。
3. 将培养瓶放入 37℃培养箱中消化 1 - 2 分钟，或在显微镜下观察细胞，待细胞间隙增大、细胞质回缩时，立即加入适量含血清的培养基终止消化。
4. 用吸管轻轻吹打细胞，使其完全脱落，制成单细胞悬液。
5. 取适量单细胞悬液，按 1:2 至 1:3 的比例接种到新的培养瓶中，加入适量新鲜培养基。
6. 将培养瓶放入 37℃、5% CO? 的培养箱中继续培养。

五、细胞培养的观察与记录

5.1 肉眼观察

定期观察培养瓶中培养基的颜色变化和细胞生长情况。若培养基颜色变黄、变浑浊，或细胞形态发生明显变化，可能提示细胞受到污染或状态不佳。

5.2 显微镜观察

使用倒置显微镜定期观察细胞的形态、生长状态和密度。正常的永生化人新生成纤维细胞呈长条状或梭形，细胞核清晰可见。

六、细胞培养的污染与防治

6.1 污染种类及预防方法

常见的细胞污染种类包括细菌、真菌、支原体和病毒污染。为防止污染，应采取以下措施：

• 严格无菌操作：在超净工作台内进行细胞操作，使用无菌器械和试剂，避免裸手接触细胞和培养基。
• 定期清洁培养环境：保持细胞培养室和超净工作台的清洁，定期消毒。
• 检查试剂和培养基：确保所用试剂和培养基本身无菌，定期更换培养基。

6.2 污染检测与处理

• 检测方法：通过肉眼观察培养基的颜色和浑浊度、显微镜下观察细胞形态和有无微生物存在、微生物培养法、PCR 检测法等，可及时发现细胞是否受到污染。
• 处理措施：一旦发现细胞受到污染，应立即对污染细胞进行处理。可将受污染的细胞置于含有抗生素的培养基中进行清洗和培养，或使用专门的细胞污染去除试剂进行处理。对于严重污染的细胞，应及时终止实验，避免污染扩散至其他细胞培养物。