乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒工作原理详解

试剂盒组成及作用

乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒主要包含乳酸脱氢酶（LDH）底物、LDH 酶、显色液和终止液。LDH 底物是 LDH 酶促反应的底物，LDH 酶催化底物发生氧化还原反应，显色液中的特定物质在反应过程中发生化学反应产生颜色变化，颜色深浅与 LDH 酶活性相关，终止液用于终止反应，稳定显色结果，便于准确测定吸光度值。

工作原理

细胞膜完整性和 LDH 释放

正常情况下，细胞膜具有选择通透性，LDH 酶主要存在于细胞质中。当细胞受到毒性物质或物理、化学因素损伤时，细胞膜的完整性被破坏，LDH 酶从细胞内释放到细胞外培养基或上清液中。LDH 酶释放量与细胞损伤程度呈正比，可用于评估细胞毒性。

酶促反应和显色原理

在试剂盒中，LDH 酶催化其底物发生氧化还原反应，生成具有特定颜色的产物。例如，常用的 LDH 底物为碘硝基四氮唑蓝（INT），在 LDH 酶作用下还原为红色的甲臜染料。显色液中的特定成分可稳定反应环境，促进反应进行，使颜色变化更加明显，便于后续测定。显色反应产物颜色深浅与 LDH 酶活性成正比，通过测定吸光度值可定量分析 LDH 酶释放量。

检测步骤及关键要点

细胞培养与处理

在合适的细胞培养皿中培养细胞，确保细胞生长状态良好，密度适宜。加入待测毒性物质或药物，设置不同浓度梯度和时间点，以评估细胞毒性。根据实验目的，设置空白对照组、阴性对照组（无毒性物质处理）和阳性对照组（已知毒性物质处理），每组设置多个复孔，确保实验数据的准确性和可靠性。

细胞上清液收集

在设定的时间点，小心移除培养皿中的细胞上清液，避免吸到细胞。可将上清液转移至新的离心管中，以防止细胞碎片和其他杂质干扰后续检测。对于贴壁细胞，如细胞未完全脱落，可用移液器轻轻吹打使细胞脱离培养皿，但需注意避免过度吹打导致细胞破裂，释放更多 LDH 酶而影响检测结果。

酶促反应与显色

在 96 孔板中加入适量细胞上清液，再加入试剂盒提供的 LDH 酶和底物溶液，轻轻混匀。然后加入显色液，避免产生气泡，气泡可能会影响后续的吸光度测定。将 96 孔板置于 37℃孵育箱中孵育一定时间，孵育时间需根据试剂盒说明书和实验需求确定，一般为 0.5 - 2 小时。在孵育过程中，酶促反应和显色反应同时进行，颜色逐渐加深。

吸光度测定与结果分析

孵育结束后，加入终止液终止反应，终止液可使反应停止并稳定显色结果。使用酶标仪在特定波长下测定吸光度值，如 490 - 570nm 波长范围是常用的选择，具体波长需根据试剂盒显色液的特性确定。根据吸光度值计算细胞毒性比例，公式为：细胞毒性比例=（实验组吸光度 - 空白对照吸光度）/（最大释放组吸光度 - 空白对照吸光度）×100%。最大释放组是指细胞经 1% Triton X-100 或其他细胞膜破坏试剂处理后，LDH 酶完全释放的组。通过绘制细胞毒性曲线，可直观呈现细胞毒性与毒性物质浓度或作用时间的关系。