Annexin V-AbFluor™ 488 细胞凋亡检测试剂盒操作使用指南

试剂盒组成及储存条件

Annexin V-AbFluor? 488 细胞凋亡检测试剂盒主要包括 Annexin V-AbFluor? 488、碘化丙啶（PI）、Annexin V 结合缓冲液（5×）等成分。不同规格试剂盒各成分的量有所不同，如 20T 规格的试剂盒包含 2mL 的 Annexin V 结合缓冲液（5×）、100μL 的 Annexin V-AbFluor? 488 和 40μL 的 PI 等。该试剂盒需在 -20°C 避光保存，有效期 12 个月。

操作步骤

细胞收集与洗涤

通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。对于悬浮细胞，4℃、300g 离心 5min 收集 1-2×10?细胞，用冰预冷的 PBS 洗涤两次。贴壁细胞需先用不含 EDTA 的胰酶消化，再离心收集细胞，同样用 PBS 洗涤两次。消化时间过长可能会破坏细胞膜结构，从而出现细胞坏死的假阳性。

染色操作

用 100μL 1×Annexin V 结合缓冲液重悬细胞，每 100μL 细胞悬液中加入 5μL Annexin V-AbFluor? 488 和 2μL PI，轻轻混匀。室温避光孵育 15min，孵育结束后置于冰上。孵育过程中可轻轻颠倒数次以加强染色效果。

检测方法

• 流式细胞仪检测 ：孵育结束后加入 400μL 1×Annexin V 结合缓冲液，轻柔混匀后置于冰上。染色后 30min 内通过流式细胞仪分析细胞。Annexin V-AbFluor? 488 的激发波长为 491nm，发射波长为 517nm；PI 的激发波长为 535nm，发射波长为 617nm。在流式细胞仪的散点图上，左下象限（Annexin V?/PI?）代表活细胞；右下象限（Annexin V?/PI?）代表早期凋亡细胞；右上象限（Annexin V?/PI?）代表凋亡晚期细胞和坏死细胞。
• 荧光显微镜检测 ：对于悬浮细胞，按照上述流式细胞仪检测的步骤操作后，将细胞悬浮置于玻片上，用盖玻片盖住细胞，尽快使用适当滤镜通过荧光显微镜分析细胞。对于贴壁细胞，细胞接种于爬片或腔室载玻片上，诱导凋亡后，除去培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，准备工作液，每 100μL 1×Annexin V 结合缓冲液添加 5μL Annexin V-AbFluor? 488 和 2μL PI，轻柔混匀后作用于细胞，室温避光孵育 15-30min，用 1×Annexin V 结合缓冲液洗涤细胞两次，载玻片上添加一滴 1×Annexin V 结合缓冲液，将细胞爬片置于载玻片上，对于细胞腔室载玻片上的细胞，添加足够 1×Annexin V 结合缓冲液覆盖细胞，也可使用抗荧光淬灭封片剂封片，然后使用适当滤镜在荧光显微镜下观察。

注意事项

• Annexin V-AbFluor? 488 和 PI 使用前需平衡到室温，且未使用的试剂分装后在 -20°C 下保存，避光，避免反复冻融。
• Annexin V 结合缓冲液使用前需用去离子水稀释至 1×，剩余试剂可在 4°C 下保存 6 个月。
• 染色后的细胞需在 30min 内进行检测，以免影响检测结果。