亚铁离子含量检测试剂盒操作使用指南

一、样品前处理规范

样品质量直接影响检测精度。

• 生物样本：血液/组织需在采集后立即置于预冷抗凝管（含EDTA或肝素），避免溶血。4℃下离心（3000rpm, 10min）分离血浆/血清，-80℃冻存不超过72小时。
• 环境样本：水样需经0.22μm滤膜过滤去除颗粒物，酸性土壤需按1:5比例用0.1M HCl振荡提取30分钟。
• 关键控制点：全程避光操作，使用棕色样本管。亚铁离子在空气中易氧化，处理时间控制在20分钟内。

二、试剂配制与稳定性

试剂活性决定检测灵敏度。

• 还原剂配制：羟胺盐酸盐溶液（试剂A）需用无氧去离子水溶解，现配现用。若溶液变黄则失效。
• 显色剂活化：Ferrozine（试剂B）冻干粉复溶后4℃避光保存，有效期72小时。复溶水温需控制在25-30℃，低温导致结晶析出。
• 缓冲体系：醋酸钠缓冲液（试剂C）pH严格校准至4.5±0.1，pH偏差0.2单位可使结果偏移15%。

三、标准曲线建立与质控

校准流程需排除基质干扰。

• 梯度设置：用硫酸亚铁铵配制0/1/2/5/10/20μM标准品，需加入与样本等量的基质溶液（如空白血清）。
• 反应条件：96孔板中依次加入50μL样本、20μL试剂A、30μL试剂B、100μL试剂C。震荡混匀后37℃孵育15分钟。
• 质控要求：每板需包含空白对照（双蒸水）、低值质控（2μM）、高值质控（15μM）。批内CV值＞5%需重做曲线。

四、分光光度检测技术要点

仪器参数设置影响读数准确性。

• 波长选择：562nm为Ferrozine-Fe2?络合物特征吸收峰，带宽设定≤5nm。
• 比色皿匹配：石英比色皿需用10%硝酸浸泡去除铁污染，玻璃皿因自身吸光值禁止使用。
• 读数校正：先以空白调零，样本吸光度＞1.0时需用PBS稀释后复测，避免信号溢出。

五、数据计算与误差分析

结果解读需结合方法学局限。

• 浓度计算：依据标准曲线方程Y=aX+b（Y：吸光度；X：浓度），R2值≥0.995方有效。
• 干扰排除：Cu2?＞10μM会竞争螯合Ferrozine，需预先加入1mM EDTA掩蔽。
• 误差来源：样本反复冻融（＞3次）导致亚铁氧化，检测值较真实值偏低8%-12%。

六、设备维护与故障处理

延长核心部件使用寿命。

• 分光光度计保养：每周用酒精棉清洁光源窗，每月用硅胶干燥剂存放比色皿仓。
• 移液器校准：50μL以下小体积移液需使用低吸附枪头，每季度检测误差（±2%为合格）。
• 常见故障：显色异常（呈紫色而非粉红色）提示试剂B失效或pH失控，需更换缓冲液。