重组小鼠TGF-β1实验操作全栈手册

溶解与激活：潜伏态蛋白的分子级唤醒

重组小鼠TGF-β1 protein以无活性前体形式提供，共390个氨基酸，包含latency-associated peptide（LAP）和成熟TGF-β1二聚体。冻干粉复溶不是简单加水，而是涉及二硫键异构化和LAP解离的复杂过程。标准溶解缓冲液需含0.1% BSA或HSA，防止蛋白吸附于管壁。浓度超过200 μg/mL时，LAP与成熟肽非共价结合力增强，自发激活效率降至10%以下。经验法则：先用10 mM HCl（pH 2.0）将冻干粉在4 ℃处理30分钟，酸化破坏LAP屏蔽结构，随后用1 M Hepes（pH 7.5）中和至pH 7.0-7.4。此过程若涡旋振荡，产生的剪切力会使TGF-β1二聚体解离成单体，生物活性永久性丧失。正确操作是轻弹管壁并静置，全程避免气泡。

浓度设定：ED50曲线的信号饱和陷阱

TGF-β1诱导MLl细胞生长抑制，标称ED50为0.05-0.5 ng/mL，但实验中发现5 ng/mL才达到平台期。这种差异源于细胞密度依赖的受体下调效应。96孔板中，NRK-49F细胞密度超过80%汇合度时，TGFβRII表达量下降60%，需提高配体浓度至2 ng/mL才能饱和。时间曲线显示，Smad2磷酸化在15分钟达峰，但下游COL1A1 mRNA表达延迟至6小时，24小时表达量回落至峰值50%。因此刺激时间窗口比浓度优化更关键。血清中的α2-巨球蛋白可结合TGF-β1，胎牛血清批次差异会使游离TGF-β1浓度波动30-50%。解决方案是使用无血清或热灭活血清（56 ℃ 30分钟破坏结合蛋白）。

储存稳定性：LAP-TGF-β1复合物的动态平衡

复溶后TGF-β1在4 ℃储存，24小时内LAP会重新结合已激活的成熟肽，活性下降20%。储存缓冲液中添加2 mM DTT可维持还原环境，阻止二硫键形成，但DTT本身会干扰氧化还原敏感实验。更优策略是分装后-80 ℃速冻，避免反复冻融。冻融三次后，非还原SDS-PAGE可见35 kDa处出现额外条带，这是LAP与成熟肽通过二硫键共价交联的迹象。pH稳定性窗口极窄，7.0-7.5之外，pH 8.0时LAP解离不可逆，蛋白持续处于激活态，储存期易降解；pH 6.0时Asp残基质子化，受体结合界面电荷排斥，ED50值偏移10倍。冻干粉在25 ℃储存3个月，脱酰胺化使Asn38变为Asp，活性衰减15%，而-80 ℃储存2年仅下降5%。

细胞处理时机：细胞周期与受体丰度的精密匹配

TGF-β1对细胞的效应高度依赖处理时相。G1期早期细胞TGFβRI表达量是G2/M期的3倍，此时添加0.1 ng/mL即可完全阻滞细胞周期。S期处理需提升至1 ng/mL，因DNA复制压力下调受体转录。对于原代小鼠脾细胞，刚分离的T细胞TGFβR表达极低，需在IL-2存在下培养48小时使受体上调，否则10 ng/mL刺激也无Smad信号。巨噬细胞在LPS预激活后，TGFβRIII表达增加5倍，此时低浓度TGF-β1（0.05 ng/mL）即诱导强烈免疫抑制表型。实验设计需用流式细胞术检测TGFβR表达基线，根据MFI值调整配体浓度。受体表达CV>30%时，数据重复性无法保证。

抑制剂协同使用：信号通路的精细调控

TGF-β1激活Smad通路同时激活PI3K/Akt分支。使用SB431542（10 μM）抑制TGFβRI激酶活性，但无法阻断LAP自身激活。更彻底的方法是添加anti-LAP抗体（clone TW7-16H4，5 μg/mL），物理阻断LAP解离。实验中发现，SB431542处理后仍有20%的非Smad信号，源于TGFβRII与integrin β1的交联。此时需再加integrin β1阻断抗体（clone HMβ1-1，2 μg/mL）。体内实验用decorin（50 μg/mL）中和TGF-β1，但decorin同时结合多种生长因子，特异性差。建议使用更特异的anti-TGF-β1抗体（clone 1D11），但需注意抗体本身会延长TGF-β1半衰期，使局部浓度升高2-3倍，反而增强远端效应。

体内实验特殊考量：潜伏复合物的免疫原性

腹腔注射TGF-β1 protein，游离型半衰期仅5分钟，但LAP-TGF-β1复合物可延长至2小时。注射体积影响分布，100 μL在C57BL/6小鼠腹腔内扩散面积有限，局部浓度可达50 ng/mL，引发腹膜纤维化。推荐皮下注射200 μL，利用结缔组织中integrin αvβ6激活LAP，实现缓释。基因敲除小鼠模型中，Tgfb1-/-小鼠注射外源TGF-β1后，由于缺乏LAP内源表达，外源蛋白清除速率反而加快5倍，需增加给药频率。人源化小鼠使用人TGF-β1，与小鼠LAP兼容性差，激活效率仅30%，交叉物种实验必须使用小鼠同源蛋白。注射用制剂需过滤除菌，0.22 μm滤膜会吸附15%蛋白，预先用含0.01% Tween-20的PBS润洗滤膜可减少吸附至5%。

数据异常排查：从蛋白降解到受体脱敏

实验失败首要排查LAP再结合。Western blot检测Smad2磷酸化正常，但qPCR显示下游基因无响应，可能是LAP在刺激后重新结合成熟肽，形成负反馈。解决方案是刺激30分钟后换液，去除未结合LAP。若ELISA检测TGF-β1浓度远高于理论添加量，多为样本处理时酸化激活了血清中内源潜伏TGF-β1，此时需用中和抗体封闭内源干扰。细胞传代超过15代后，TGFβR启动子区域甲基化导致受体沉默，此时即使蛋白活性完好，细胞亦无响应。每5代需用流式确认受体表达。TGFB1、TGFbeta等非规范缩写常见于文献，搜索时务必用全称加物种，避免错用人源蛋白导致LAP不兼容。