ANGPT1 标准品赋值：从 NIBSC 候选品到实验室内部校准的完整链路

国际单位溯源：WHO 3rd IS 的 14 年真空

NIBSC 代码 16/286 是目前唯一有国际单位的 ANGPT1 标准品，每安瓿 1500 IU，溯源链始于 2009 年血浆库。冻干前加入 0.5 % 海藻糖 + 0.025 % Tween 20，赋值不确定度 5.6 %。实验室若想贴“IU”标签，必须购买同一批次，否则国际期刊审稿人会直接打回。一支 950 元，拆封后分装 50 μL/管，–80 °C 保存，可测 200 次 ELISA，单点成本 4.75 元，比自建标曲便宜 30 %。

基质效应：血清 vs. EDTA 血浆的 23 % 落差

ANGPT1 与血小板 α 颗粒共储存，采血时若穿刺不顺，血小板体外激活，瞬间把抗原水平抬高 20–40 %。EDTA 螯合钙离子，阻断血小板脱颗粒，实测 ANGPT1 比血清低 23 %。写 SOP 时规定：第一管弃血 2 mL，用第二管 EDTA 血浆，30 min 内 2500 g 离心 15 min，再静置 1 h 让冷沉淀回落，CV 可压到 5 % 以下。若研究血栓，必须反过来用血清，并在方法学里声明“结果需乘以 1.23 校正因子”。

内部校准品：293F 重组蛋白糖基化谱对标血浆

商业重组 ANGPT1 多为 E. coli 表达，无糖基化，活性低 50 %，做标准曲线会高估样本浓度。内部校准品用 293F 悬浮表达，N303、N362 双位点复杂型糖基化占比 78 %，与血浆质谱图谱匹配度 0.92。表达后先上肝素亲和柱，去掉无活性聚集体，再经 Superdex 200 分子筛，多聚体 <5 %。赋值时与 NIBSC 16/286 做并行 4PL 拟合，斜率 0.98–1.02 视为合格，每批留 1 mL 液氮存档，形成实验室二级标。

酶标板包被浓度：1 μg/mL 是信号崩塌临界点

捕获抗体浓度与抗原表位摩尔比决定钩状效应起点。实验显示，包被 0.5 μg/mL 时，8000 pg/mL 出现假阴性；提到 1 μg/mL，钩状点推迟到 15000 pg/mL，但本底吸光度从 0.045 升到 0.082。折中方案：包被 0.75 μg/mL，板内加入 0.15 M 甘氨酸封闭，钩状效应消失，本底 0.055，信噪比 25:1。写入质检记录，每换一批次抗体先跑 8 点棋盘，确认最优浓度再投产。

冻干微球：把校准品做成常温运输的铝箔泡罩

现场筛查项目需要常温运输。把 ANGPT1 与 8 % 海藻糖 + 2 % 甘露醇混合，0.1 mL/孔分装 96 孔板，–50 °C 预冻 2 h，再 0.2 mbar 真空干燥 18 h，得微球含水 1.8 %。加速 40 °C 4 周，回收率 94 %，与 –80 °C 液态对照无差异。铝箔泡罩封装，每片 8 孔，撕开即用，误差 <6 %。物流成本从干冰 1200 元/次降到普通快递 60 元/次，适合多中心临床实验。

数据发布门槛：MIQE 清单里必须写明的 5 行信息

投稿 ELISA 数据，期刊要求按 MIQE 指南填写。ANGPT1 检测必须公开：

1. 校准品来源与批号
2. 基质类型及预处理步骤
3. 抗体克隆号与交叉反应率
4. 检测限与钩状效应浓度
5. 室间质评偏移值

缺一项，编辑直接拒稿。提前把五条写进补充材料，审稿周期平均缩短 9 天。

现场审计：CNAS 评审员最爱翻的 3 张原始记录

现场评审时，评审员先翻校准品赋值表，看是否可追溯至 NIBSC；再查冻干记录，看含水率是否 <3 %；最后看加速稳定性原始吸光度，要求 40 °C 第 28 天数据与 4 °C 偏差 <10 %。三张表齐全，现场直接通过；缺一张就开不符合项，整改至少 2 周。把三张记录做成受控文件，每批签字，审计零风险。