TLR2 技术参数全景：让“膜蛋白哨兵”把细菌碎片变成可量化数据

做流式、做报告基因、做动物，参数对不上，同一株细菌都能跑出两个炎症世界

定量活性：NF-κB luciferase EC50 0.25 ng/mL Pam3CSK4

HEK-Blue hTLR2 稳转系，每孔 5×10? 细胞，加 Pam3CSK4 刺激 16 h，QUANTI-Blue 测 SEAP 吸光度。EC50 0.25 ng/mL 为合格批标，斜率 ?1.05 到 ?0.95 之间无钩状。EC50>0.4 ng/mL 的批次受体表达量不足，换批比换激动剂省钱。

线性区间：Pam3CSK4 0.1–1000 ng/mL，R2≥0.998

下限 0.1 ng/mL 对应血清背景 LPS 0.01 EU/mL，上限 1000 ng/mL 能覆盖化脓性链球菌提取物峰值。高剂量 2000 ng/mL 出现信号回落 15%，为受体饱和。做抑制剂筛选时，固定 Pam3CSK4 在 2 ng/mL，落在直线段，IC50 不会飘。

交叉配体：TLR1/6 双辅助，偏差 ≤8%

TLR2 需 TLR1 识别三酰脂肽，TLR6 识别二酰脂肽。报告基因系统同时转染 TLR1/6，Pam3CSK4 刺激偏差 ≤8%。偏差>12% 提示辅助受体表达失衡，抑制剂评价会误判“拮抗”为“激动”。收货先测 TLR1/6 表达量 Western，比值 1:0.9–1.1 才算合格。

批间差 ≤6%：30 ng/mL Pam3CSK4 质控点

受体为膜蛋白，批次冻存复活后表达量易漂移。厂家加 10% DMSO 慢冻，维持 90% 存活率，批间 CV 压到 5.2%。用户抽三批，30 ng/mL 点 SEAP 读数 CV>6% 直接退货，避免抑制剂实验里阳性孔灰度来回跑。

内毒素背景：Pam3CSK4 本身<0.01 EU/mg

合成脂肽常带 LPS 残留，背景 0.05 EU/mg 就能让 TLR4 旁路激活，SEAP 信号虚高 20%。出厂加 LAL 实测，限值<0.01 EU/mg。收货自己做 10 ng/mL 刺激 + Polymyxin B 10 μg/mL 阻断，信号降幅>90% 说明 LPS 干净，否则退批。

稳定性：?80 ℃ 24 个月，37 ℃ 7 天偏差 <7%

冻干 Pam3CSK4 37 ℃ 7 天活性掉到 93%，对应夏季运输 3 天失效风险<3%。溶液态 ?20 ℃ 3 次冻融 CV≤5%。实验室收到 10 mg 大包装，按 1 mg/管分装，液氮气相保存，一次取用避免反复，实测 EC50 漂移<0.02 ng/mL。

平台迁移：ELISA→HTRF→AlphaLISA

HTRF 比值信号背景比 ELISA 低 5 倍，同一上清 NF-κB p65 读数×0.21 对齐 ELISA。AlphaLISA 受血清干扰小，读数×0.18。做多平台对比时，先把浓度归一到 ELISA 当量，再画柱状图，审稿人不会质疑量纲不一致。

血清兼容：20% 人血清信号抑制 ≤15%

血清含 sCD14、sTLR2 等诱饵受体，能把 2 ng/mL Pam3CSK4 信号拉低 15%。抑制剂筛选时，对照孔加同体积血清，校正后 IC50 才真实。缺失血清校正的数据，申报时会被判“未考虑基质效应”。