永生化小鼠野生型主动脉内皮细胞操作使用详解

在细胞培养领域，Immortalized Mouse WildType Aortic Endothelial Cells（iMAEC-WT，永生化小鼠野生型主动脉内皮细胞）具有重要研究价值。掌握其规范化的操作使用流程，不仅有助于实验数据的准确性与可靠性，还能最大限度地发挥细胞模型的优势。

细胞复苏操作要点

从液氮程序降温冻存盒中取出冻存管时，必须佩戴防护手套与护目镜，因为液氮低温可能导致冻伤与冷冲击。将冻存管迅速置于 37℃水浴中摇晃，使细胞在 1 分钟内快速解冻，这一过程能有效防止细胞内冰晶形成对细胞结构的破坏。

解冻后的细胞需立即用无菌离心管收集，加入适量含有 10%胎牛血清与青霉素 / 链霉素双抗的完全培养基，以 800rpm 离心 5 分钟，去除残留的 DMSO（二甲基亚砜），避免其对细胞造成毒性。

细胞计数后，按照合适密度接种至预先包被好细胞外基质的培养瓶或培养皿中，初始培养阶段应保证培养环境稳定，培养箱温度严格设定为 37℃，CO?浓度维持在 5%，湿度保持在 95%以上，细胞贴壁后 4 - 6 小时内观察细胞状态，正常情况下细胞会逐渐恢复新陈代谢与生长活力。

传代培养关键参数

当细胞生长至培养容器的 80% - 90%融合度时，便是进行传代的最佳时机。传代比例依据细胞生长速度与实验需求而定，通常建议在 1:3 至 1:6 范围内。

使用 0.25%胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 消化液时，需精准把控消化时间，一般 37℃下 1 - 2 分钟即可，过度消化会导致细胞膜受损与细胞骨架破坏，出现细胞碎屑增多、细胞活力下降等问题。

新培养基添加后，轻柔吹打使细胞均匀分布，避免产生细胞团块，随后置于培养箱继续培养，整个传代操作需在无菌环境下进行，严格遵守层流台操作规范，防止细菌、真菌污染，一旦发现污染迹象，应立即终止实验，对培养器具进行消毒处理。

冻存策略与注意事项

冻存操作是细胞保存的关键环节，优质的冻存程序能确保细胞在长期保存后仍具备良好的复苏活性。冻存前，细胞需处于良好的生长状态，传代 1 - 2 次后，用胰蛋白酶消化并收集细胞，用冷的冻存液重悬细胞，调节细胞密度至合适浓度，一般为 1×10? - 5×10? cells/ml。

将细胞悬液分装入提前预冷的冻存管中，做好标记，记录细胞名称、冻存日期、代数等信息。放入程序降温盒后，按照每分钟下降 1℃的速度缓慢降温，直至 - 80℃，24 小时后转移至液氮罐长期保存，这一过程能有效降低细胞内水分结晶对细胞的损伤，提高细胞复苏后的存活率与活性。

定期对液氮罐进行检查维护，确保液氮充足，防止因液氮泄漏导致细胞失活，同时建立完整的细胞冻存档案，方便后续细胞复苏与实验安排。