永生化人主动脉内皮-SV4细胞培养操作指南

一、细胞培养准备工作

在开展永生化人主动脉内皮-SV4细胞培养前，实验室环境的无菌性是关键。超净工作台需提前用紫外线消毒30分钟以上，以杀灭空气中的微生物。通风系统开启后，需维持正压环境，防止外界空气中的杂质进入操作区域。培养容器如培养瓶、培养皿等，应采用高压蒸汽灭菌法处理，温度控制在121℃，压力15-20psi，持续15-20分钟。选择合适的细胞培养耗材至关重要，培养瓶需具备良好的生物相容性和光学透明度，以确保细胞能够正常贴壁生长并便于观察。

培养基是细胞生存的“土壤”，其成分繁多。基础培养基如DMEM或RPMI 1640，为细胞提供碳水化合物、氨基酸和维生素等营养物质。血清作为关键补充，通常添加10%-15%胎牛血清，它含有细胞生长因子、激素和黏附因子等。但血清质量参差不齐，需根据细胞特性筛选。若使用含血清培养，细胞生长迅速但存在成分不可控的风险；若用无血清培养基，培养环境更稳定，但成本较高。培养基pH值应维持在7.2-7.4，可添加HEPES缓冲液增强稳定性，因细胞代谢产生的酸性物质可能改变pH值，影响细胞生长。为抑制杂菌生长，常添加青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL），但过量抗生素会损害细胞活性。

二、细胞复苏与传代

细胞复苏时，需将冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴中摇晃至无冰晶。动作要迅速，因为细胞在低温保存时处于休眠状态，快速升温可减少细胞损伤。复苏后的细胞用培养基稀释并离心，去除冻存液中的DMSO，防止其毒性作用。离心力控制在1200rpm，时间5分钟，过高的离心力会导致细胞破碎。

细胞传代时，当细胞密度达80%-90%汇合度，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1-2分钟，直到细胞从培养瓶壁上脱落。胰蛋白酶浓度和消化时间需精准控制，浓度过高或时间过长会破坏细胞表面蛋白，影响细胞后续生长和功能。消化后的细胞用含血清培养基终止反应，并轻柔吹打制成单细胞悬液，分装到新的培养瓶中。传代比例一般为1:2或1:3，给予细胞足够生长空间，避免过度拥挤导致细胞生长抑制。

三、细胞培养过程中的污染防控与监测

细胞培养过程中，污染是“隐形杀手”。细菌污染会使培养基迅速浑浊，细胞形态异常；真菌污染则表现为培养基表面的绒毛状或棉絮状菌落；支原体污染虽无明显肉眼变化，但会消耗培养基中的精氨酸等营养物质，抑制细胞生长。为预防污染，所有培养操作应在无菌环境下进行，操作人员需严格无菌操作。定期更换培养基能有效清除潜在污染物，维持培养环境稳定。一旦发现污染，应立即停止实验，对受污染的细胞和培养器具进行消毒处理，防止污染扩散。

细胞生长状态的监测是确保实验顺利的关键。显微镜观察是常用方法，健康细胞形态规则，贴壁良好，细胞质清晰；而受损或老化细胞形态不规则，胞质颗粒增多。定期计数细胞，可计算细胞倍增时间，评估细胞生长活力。细胞活性检测方法多样，MTT法通过检测细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性评估细胞活性，操作简便、结果可靠。流式细胞术可分析细胞周期分布、细胞凋亡率，提供更全面的细胞状态信息。

四、细胞冻存与长期保存

长期保存细胞时，冻存液的配制是关键。常用冻存液含90%胎牛血清和10%二甲基亚砜（DMSO）。DMSO作为保护剂，能降低细胞内水分冰点，减少冰晶形成对细胞的机械损伤。冻存过程需缓慢降温，可使用程序降温仪，从室温以每分钟1℃的速度降至-80℃，然后转移到液氮罐中。快速降温会导致细胞内水分快速结冰，形成冰晶刺破细胞膜；而缓慢降温使细胞内水分逐渐向外转移，在细胞内形成少量小冰晶，减少损伤。液氮罐应定期检查液氮水平，确保细胞处于-196℃的低温环境中长期保存。