永生化大鼠中脑(AF5)细胞系- SV40T (T155g) 的操作使用

细胞复苏操作

• 准备培养基和耗材 ：准备适合细胞生长的培养基，如 DMEM 高糖培养基，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素混合液。同时准备好培养瓶、离心管、吸管等耗材，并确保所有器材均经过无菌处理。
• 取出冻存细胞 ：从液氮罐或 - 130°C 以下的保存环境中取出冻存的细胞，迅速放入 37°C 水浴中快速解冻，轻轻摇晃使其均匀受热，直到冻存管内的干冰完全溶解。
• 细胞处理与培养 ：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，加入适量的培养基轻轻吹打混匀，然后进行离心，去除冻存液。再用新鲜培养基重悬细胞，将其接种到预先准备好的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞均匀分布，放入 37.0°C、5% CO? 的培养箱中进行培养。

细胞传代操作

• 观察细胞状态 ：在倒置显微镜下观察细胞的生长状态和密度，当细胞生长至培养瓶壁的 80%-90% 时，即可进行传代操作。
• 细胞消化与收集 ：弃去培养瓶中的旧培养基，加入适量的 PBS 清洗细胞，去除残留的培养基和杂质。加入胰蛋白酶消化液，在 37°C 下孵育 1-2 分钟，观察细胞是否从瓶壁脱落。当细胞大部分脱落后，加入含血清的培养基终止消化，用吸管轻轻吹打细胞，使其分散成单个细胞或小细胞团，然后将细胞悬液转移至离心管中，进行离心收集细胞。
• 细胞计数与接种 ：对离心后的细胞进行计数，根据需要的传代比例，将细胞悬液按适当的比例接种到新的培养瓶中，加入新鲜的培养基，轻轻摇晃培养瓶使细胞均匀分布，放入培养箱中继续培养。

细胞冻存操作

• 准备冻存液和冻存管 ：冻存液一般由基础培养基、胎牛血清和 DMSO 按一定比例配制而成，如含 90% 胎牛血清和 10% DMSO 的冻存液。准备好标记好细胞名称、冻存日期等信息的冻存管。
• 细胞收集与处理 ：将培养好的细胞用胰蛋白酶消化并收集，离心去除培养基和消化液，用冻存液重悬细胞，调整细胞密度至适当浓度，一般为 1×10^6 cells/ml 左右。
• 细胞分装与冻存 ：将细胞悬液分装到冻存管中，每管 1-2ml。将冻存管放入 - 80°C 冰箱中预冻 2-4 小时，然后转移到液氮罐中长期保存。在冻存过程中，要尽量保持温度的均匀下降，以减少细胞内冰晶的形成对细胞的损伤。

培养基的配方与优化

• 基础配方 ：常用的培养基为 DMEM 高糖培养基，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素混合液。此外，还可以根据细胞的具体需求添加其他生长因子和营养成分，如神经生长因子、胰岛素等，以促进细胞的生长和增殖。
• 优化方法 ：在细胞培养过程中，可以根据细胞的生长状态和实验需求对培养基进行优化。例如，如果细胞生长缓慢，可以适当增加胎牛血清的含量；如果细胞容易发生凋亡，可以添加一些抗凋亡因子，如 Bcl-2 等。

培养条件的控制

• 温度和气体条件 ：永生化大鼠中脑(AF5)细胞系- SV40T (T155g) 通常在 37.0°C、5% CO? 的培养箱中进行培养。温度和 CO? 浓度的稳定对于维持细胞的正常生长和代谢非常重要。CO? 的作用是维持培养基的 pH 值，如果 CO? 浓度过高或过低，都会导致培养基的 pH 值发生变化，从而影响细胞的生长。
• 湿度控制 ：培养箱内的湿度也应保持在适当的水平，一般要求湿度在 95% 以上。可以通过在培养箱内放置水盘或使用加湿器来增加湿度。湿度不足会导致培养基中的水分蒸发，使培养基的体积减少，浓度升高，从而影响细胞的生长。

细胞污染的预防与处理

• 预防措施 ：在细胞培养过程中，应严格遵守无菌操作规程，避免细胞受到污染。所有与细胞接触的器材和试剂都应经过无菌处理，如高压灭菌、过滤除菌等。操作人员应戴口罩、手套，避免皮肤和呼吸道的微生物接触到细胞。
• 污染检测与处理 ：定期检查细胞的生长状态，观察是否有细菌、真菌或支原体等污染迹象。如果发现细胞培养液变浑浊、细胞表面有菌斑或细胞形态发生异常变化，应及时进行污染检测。一旦确认细胞受到污染，应立即采取措施进行处理，如使用抗生素、抗真菌药物等，但要注意药物的使用浓度和时间，以免对细胞造成毒性作用。