永生化小鼠施万细胞的操作使用指南

永生化小鼠施万细胞简介

永生化小鼠施万细胞（如 IMS32）是从 ICR 小鼠大脑中分离得到的，具有贴壁、纺锤形生长特性，可通过自然永生化等方式获得。其能表达胶质细胞标记物（如 S100、GFAP、p75NTR）、参与施万细胞发育和周围髓鞘形成过程中的转录因子（如 Krox20、Oct6、PAX3 和 SOX10），以及神经营养因子（如 NGF、BDNF、GDNF 和 CNTF）。

培养基的配制与选择

• 基础培养基 ：常用 PriCoat? T25 烧瓶或应用细胞外基质以促进细胞粘附，培养基为 PriGrow III + 10% FBS + 1% 青霉素 / 链霉素溶液，培养条件为 37℃、5% CO?。
• 无血清培养基 ：也可采用无血清培养基进行培养，需根据细胞类型和实验需求进行优化调整。

细胞的复苏与冻存

• 细胞复苏 ：收到冻存细胞后，检查冻存管是否有解冻破损现象。将冻存管放入 37℃水浴中快速融化，一般 1 分钟左右。然后将细胞悬液转移至离心管，用培养液稀释后低速离心 3-10 分钟，去除上清，加入新鲜培养液后培养。收到培养细胞时，用 75% 酒精喷洒细胞瓶消毒，放置培养箱静置 2-4 小时稳定细胞状态，之后显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。
• 细胞冻存 ：选择状态良好的细胞，消化后制成单细胞悬液，按冻存数量加入含 5% DMSO 的冻存液，轻轻混匀后分装于冻存管，放入 - 80℃冰箱中，24 小时后转入液氮罐保存。

细胞的传代

当细胞密度达到 80% 左右时，即可进行传代。传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加入 0.25%Trypsin-0.53mM EDTA 消化液，放入培养箱消化 1-2 分钟，显微镜下观察细胞，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲培养瓶后，加含 10% 血清的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落，吸出至离心管，1000rpm 离心 5-8 分钟，弃去上清，补加完全培养基吹匀。
4. 按 1:2 至 1:4 的比例，将细胞悬液分到新的培养瓶中，加入适量完全培养基，放入培养箱继续培养。

细胞培养的观察与记录

• 肉眼观察 ：主要观察培养基的颜色变化及细胞生长情况。若培养基颜色变黄、变浑浊等，可能提示细胞状态不佳或受到污染。
• 显微镜观察 ：定期在倒置显微镜下观察细胞的形态、生长状态等。正常的永生化小鼠施万细胞呈纺锤形，立体感强，伸出双极、三极长而纤细的突起彼此交织成网络。

细胞培养的污染与防治

• 污染种类 ：常见的有细菌、酵母菌、霉菌和病毒等污染。
• 预防方法 ：严格无菌操作技术，如在超净工作台内进行操作、使用无菌器械和试剂等；保持操作环境清洁；使用良好的细胞来源和培养基配制。
• 检测与处理 ：可通过肉眼直接观察法、培养检查法、显微镜观察法、PCR 检测等方法检测污染。一旦发现污染，应及时采取相应的处理措施，如丢弃培养物、使用抗生素等。