永生化小鼠脑内皮细胞 - SV40 操作使用详解

在细胞培养领域，永生化小鼠脑内皮细胞 - SV40 是一种重要的细胞模型，以下是其操作使用方面的详细介绍。

一、培养条件

（一）培养基成分

该细胞系推荐使用 EGM-2 MV 培养基，添加 5% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 / 链霉素溶液。FBS 能为细胞生长提供必要营养物质、激素和生长因子，双抗溶液则可防止细菌和真菌污染。

（二）培养环境

细胞应在 37℃、5% CO?的恒温培养箱中培养。此环境有助于维持培养基的 pH 值稳定，同时为细胞提供适宜的生长温度和气体条件，使其 metabolic processes 运行更贴近体内生理环境，从而确保细胞正常生长和代谢。

二、传代操作

（一）传代比例

一般建议将细胞以 1:2 至 1:3 的比例进行传代培养。当细胞生长至覆盖培养瓶底面积的 80% - 90% 时，即可进行传代，避免细胞过度拥挤导致生长抑制和细胞状态下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液进行细胞消化。消化时，需密切观察细胞形态变化，一般在 37℃下消化 1 - 3 分钟，待细胞间隙增大、细胞边缘变圆并开始从培养瓶壁上脱落时，立即加入含血清的培养基终止消化。然后轻轻吹打细胞，使其完全脱落并形成均匀的细胞悬液，再进行分瓶培养。

三、冻存与复苏

（一）细胞冻存

冻存培养基由基础培养基、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）组成，比例为 90% FBS + 10% DMSO。将细胞收集并离心，弃去上清液后，用冻存培养基重悬细胞，调整细胞密度至 5×10? - 1×10? cells/mL 左右，分装于冻存管中，每管 1 mL。将冻存管置于程序降温盒中，放入 - 80℃冰箱中过夜，次日转移至液氮中长期保存。缓慢降温有助于细胞逐渐适应低温环境，减少细胞内冰晶的形成，从而提高细胞复苏后的存活率。

（二）细胞复苏

从液氮中取出冻存管，立即放入 37℃水浴中快速摇晃解冻，使细胞在 1 分钟左右完全解冻。用 70% 酒精消毒管外壁后，移入无菌超净工作台内。将冻存管中的细胞悬液全部转移到含有 9 mL 完全培养基的离心管中，用移液管轻轻吹打混匀，使 DMSO 浓度稀释至 10% 以下，以降低其对细胞的毒性。接着在 1000rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞接种于培养瓶中，放入 37℃、5% CO?培养箱中培养。

四、基因改造机制

该细胞系是通过将 SV40 基因导入小鼠脑内皮细胞而获得永生化。SV40 是一种病毒，其基因成分整合到宿主细胞基因组中，从而破坏细胞正常的生长调控机制，使细胞获得无限增殖的能力。SV40 大 T 抗原可以与细胞内的多种蛋白质相互作用，如与视网膜母细胞瘤蛋白（RB）和 p53 蛋白结合，使其失去正常的生理功能，细胞周期调控失效，细胞得以突破正常的增殖限制，实现无限增殖。

五、细胞应用

（一）血脑屏障机制研究

永生化小鼠脑内皮细胞 - SV40 是研究血脑屏障机制的重要细胞模型。血脑屏障是由脑微血管内皮细胞、细胞外基质、周细胞和星形胶质细胞足突等组成的复合体，具有限制物质从血液进入大脑的作用，对维持中枢神经系统内环境的稳定至关重要。通过使用该细胞系，可深入探究血脑屏障的形成、维持以及在病理状态下的改变机制，如细胞间紧密连接的形成与调节、转运系统的功能等。

（二）药物筛选

该细胞系可用于药物穿透血脑屏障的研究。在药物研发过程中，了解药物能否有效穿透血脑屏障是开发治疗中枢神经系统疾病药物的关键环节。将永生化小鼠脑内皮细胞 - SV40 培养在特殊的实验装置中，如 Transwell 小室，模拟血脑屏障的结构和功能，然后将药物加入到上室，通过检测药物在下室的浓度变化，评估药物的渗透性，为筛选能够有效透过血脑屏障的药物提供实验依据。