永生化小鼠胚胎囊性纤维化成纤维细胞 - Ras 操作使用指南

在生物医学研究领域，永生化小鼠胚胎囊性纤维化成纤维细胞 - Ras（Immortalized Mouse Embryonic Cystic Fibrosis Fibroblasts - Ras）是一种极具价值的细胞模型，为深入探究相关疾病机制及药物筛选提供了有力支持。以下是关于该细胞系操作使用的详细指南。

一、细胞培养条件

（一）培养基配制

该细胞系通常使用改良 Eagle 培养基（DMEM）进行培养，需在培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS），以提供细胞生长所需的营养物质、激素和生长因子等，还需添加 1% 青霉素 - 链霉素双抗溶液，防止细胞培养过程中的细菌和真菌污染。

（二）培养环境

细胞培养应在 37℃、5% CO?的恒温培养箱中进行，这样的环境有助于维持培养基的 pH 值稳定，并为细胞提供适宜的生长温度和气体条件，以模拟体内生理环境，确保细胞的正常生长和代谢。

二、细胞传代操作

（一）传代比例

一般建议将细胞以 1:2 至 1:3 的比例进行传代培养。当细胞生长至覆盖培养瓶底面积的 80%-90% 时，即可进行传代操作，以防止细胞过度拥挤导致生长抑制和细胞状态下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液进行细胞消化。在消化过程中，需密切观察细胞形态变化，一般在 37℃下消化 1-2 分钟，待细胞间隙增大、细胞边缘变圆并开始从培养瓶壁上脱落时，立即加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其完全脱落并形成均匀的细胞悬液，然后进行分瓶培养。

三、细胞冻存与复苏

（一）细胞冻存

1. 冻存培养基配制 ：冻存培养基一般由基础培养基、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）组成，比例为 50% 基础培养基 + 40% FBS + 10% DMSO。DMSO 是一种常用的细胞冻存保护剂，可降低细胞内外溶液的冰点，减少细胞内水分结冰对细胞造成的损伤。
2. 冻存操作 ：将细胞收集并离心，弃去上清液，用冻存培养基重悬细胞，调整细胞密度至 1×10^6^ cells/mL 左右，将细胞悬液分装于冻存管中，每管 1 mL。将冻存管置于程序降温盒中，放入 - 80℃冰箱中过夜，次日转移至液氮中长期保存。缓慢降温的过程有助于细胞逐渐适应低温环境，减少细胞内冰晶的形成，从而提高细胞复苏后的存活率。

（二）细胞复苏

1. 快速解冻 ：从液氮中取出冻存管，立即放入 37℃水浴中快速摇动，使细胞在 45-90 秒内完全解冻。快速解冻可使细胞迅速通过最易受损的温度区域，减少细胞在低温条件下受冻的时间，降低细胞受损程度。
2. 细胞处理 ：将冻存管从水浴中取出后，用 70% 酒精消毒管外壁，移入无菌超净工作台内。将冻存管中的细胞悬液全部转移到含有 9 mL 完全培养基的离心管中，用移液管轻轻吹打混匀，使冻存管中的 DMSO 浓度稀释至 10% 以下，以减少 DMSO 对细胞的毒性作用。然后在 300×g 的离心力下离心 3 分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞接种于培养瓶中，放入 37℃、5% CO?培养箱中培养。

四、细胞基因改造机制

该细胞系是通过将 Ras 基因导入小鼠胚胎囊性纤维化成纤维细胞而获得永生化。Ras 基因是一种原癌基因，可编码 21kD 的 GTP 酶。正常细胞中，Ras 蛋白处于活性状态时，能够结合 GTP 并激活下游的信号通路，如 MAPK 信号通路，参与细胞生长、分化、凋亡等生理过程的调控。而在该细胞系中，Ras 基因的异常表达或激活可破坏细胞正常的生长调控机制，使细胞获得无限增殖的能力，从而实现永生化。

五、细胞应用

（一）疾病研究模型

永生化小鼠胚胎囊性纤维化成纤维细胞 - Ras 是研究囊性纤维化疾病的重要细胞模型。通过在体外模拟囊性纤维化的病理环境，可深入探究该疾病的发生发展机制，如细胞的异常增殖、凋亡抗性以及与炎症反应等的关系，为开发针对性的治疗方法提供理论基础。

（二）药物筛选

该细胞系可用于高通量药物筛选，用于筛选能够调节细胞增殖、诱导细胞凋亡或改善囊性纤维化相关病理特征的药物。由于细胞具有永生化特性，可在较长时间内稳定地进行药物处理和实验观察，提高了药物筛选的效率和可靠性。