永生化小鼠肝窦内皮细胞 - SV40 培养与应用指南

一、细胞特性与应用价值

永生化小鼠肝窦内皮细胞 - SV40 是一种经过 SV40 大 T 抗原转化后获得永生化特性的细胞系。这些细胞保留了正常肝窦内皮细胞的许多重要特性，如高内皮细胞典型的孔隙结构，允许血液成分与肝细胞之间进行物质交换。它们在肝脏生理学、病理学以及药物研发等领域具有重要的应用价值。在肝脏生理学研究中，可用于深入探究肝窦内皮细胞在物质代谢、免疫调节等方面的功能。在肝脏疾病研究领域，可用于研究肝窦内皮细胞在肝纤维化、肝硬化等疾病发生发展过程中的作用机制。此外，在药物研发过程中，可用于评估药物对肝窦内皮细胞的毒性作用，为药物的安全性评价提供实验依据。

二、细胞培养前的准备工作

（一）培养设备与器材检查

在进行细胞培养之前，对培养设备和器材进行全面检查是确保实验顺利进行的关键步骤。首先检查细胞培养箱，确认其温度、湿度和 CO? 浓度的控制系统是否正常。一般来说，细胞培养箱的温度应精准维持在 37℃，湿度需保持在 95% 左右，而 CO? 浓度则应稳定在 5%。这三个参数对于模拟细胞在体内的生长环境至关重要。如果发现培养箱的任何参数出现偏差，应立即进行校准或维修，以确保细胞能够在适宜的环境中生长。

显微镜是观察细胞形态和生长状态的必备工具。检查显微镜的目镜和物镜是否清洁无污，调节焦距的装置是否灵活有效。只有通过清洁且功能正常的显微镜，才能清晰准确地观察到细胞的细微结构，如细胞核的形状、细胞质的分布以及细胞间的连接情况等，从而及时发现细胞生长过程中的异常变化。此外，还需检查培养皿、离心管等耗材的质量。确保培养皿表面平整光滑、无划痕、无裂纹，离心管密封性能良好、无破损。使用前，对所有耗材进行高压灭菌处理（121℃，15 - 20 分钟）或直接使用无菌包装的一次性耗材，以防止细菌、真菌等微生物污染细胞，影响实验结果。

（二）培养基配制与灭菌

配制适合永生化小鼠肝窦内皮细胞 - SV40 生长的培养基是细胞培养成功的另一个关键因素。基础培养基通常选择 Endothelial Cell Growth Medium（ECGM）或 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）。这些培养基含有细胞生长所需的基本营养成分，如碳水化合物、氨基酸和维生素等。除了基础培养基外，还需添加 10% - 15% 的胎牛血清（FBS），胎牛血清富含多种细胞生长因子、激素和黏附因子，能够为细胞提供丰富的营养支持，促进细胞的生长和增殖。同时，加入青霉素 - 链霉素溶液（100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）以防止细菌和真菌的污染。根据不同实验的具体需求，还可以添加其他成分，如血管内皮细胞生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）等，以优化细胞的生长环境，满足细胞在不同生长阶段的营养需求。

配制好的培养基需要进行高压蒸汽灭菌处理。将培养基分装到合适的容器中，设置压力为 100 - 105 kPa，温度为 121℃，灭菌 15 - 20 分钟。在灭菌过程中，要确保培养基不过度沸腾，以免造成成分的丢失或变性。灭菌完成后，将培养基调至 4℃保存，待使用前再恢复至室温，以保持培养基中各种成分的稳定性和活性。

三、细胞复苏流程

从冻存状态复苏永生化小鼠肝窦内皮细胞 - SV40 是细胞培养的起始步骤，正确的操作可以确保细胞的活性和正常生长。首先准备一个 37℃左右的水浴锅，将含有冻存细胞的冻存管从液氮罐中迅速取出，立即放入水浴锅中，并用镊子快速摇动冻存管，使细胞在 1 - 2 分钟内完全融化。快速融化可以最大限度地减少细胞在低温到常温过程中受到的损伤，提高细胞的复苏率。

然后，用 75% 的酒精对冻存管外部进行消毒，以防止外界细菌、真菌等微生物污染细胞。在无菌操作台内，将冻存管内的细胞悬液快速加入到含有适量培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，使细胞均匀分散在培养基中。接下来进行离心操作，一般设定离心速度为 1000 - 1200rpm，离心时间为 5 分钟左右，使细胞沉淀到离心管底部。离心完成后，小心弃去上清液，注意不要倒掉沉淀的细胞。加入新鲜的培养基，用移液管轻轻吹打细胞沉淀，使其重新悬浮在培养基中。将细胞悬液转移至培养皿中，轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布在整个培养皿表面，放入 37℃、5% CO? 的细胞培养箱中静置培养，让细胞逐渐恢复活性并开始贴壁生长。在复苏后的 24 小时内，要密切观察细胞的生长状态，及时更换培养基，以确保细胞能够顺利适应新的培养环境。

四、细胞培养过程中的观察与记录

定期观察永生化小鼠肝窦内皮细胞 - SV40 的生长状态是细胞培养过程中的重要环节。通常每天至少观察一次细胞，观察内容包括细胞的形态、颜色、细胞密度以及培养基的情况等。正常生长的肝窦内皮细胞呈扁平状或梭形，细胞边缘清晰，胞质均匀，颜色为淡黄色或透明，细胞之间相互连接成网状结构。

若观察到细胞颜色变深、浑浊，或者出现大量漂浮物，则可能提示细胞受到细菌、真菌或支原体等微生物的污染，或者细胞已经死亡、变性。此时需要立即进行处理，如更换培养基、使用抗生素等，严重污染的细胞可能需要丢弃，以防止污染扩散到其他细胞培养体系中。

同时，要详细记录细胞的生长情况，包括细胞的形态变化、细胞密度的估计值（如以细胞占据培养皿面积的百分比表示）、培养基的更换时间、细胞传代的时间和比例等信息。这些记录有助于了解细胞的生长规律，为后续实验安排提供参考，也有助于在出现问题时追溯原因，及时调整培养条件或采取相应的解决措施。例如，通过观察细胞在不同培养基成分下的生长情况，可以优化培养基配方，提高细胞的生长质量和实验重复性。

五、细胞传代操作

当永生化小鼠肝窦内皮细胞 - SV40 生长到培养皿面积的 80% - 90% 左右时，需要进行传代操作，以避免细胞因密度过高而出现接触抑制，影响细胞的正常生长和功能。传代前，先用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗培养皿中的细胞，目的是去除细胞表面残留的培养基和一些可能影响细胞传代的杂质。接着，加入适量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用浓度为 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA）到培养皿中，胰蛋白酶可以分解细胞间的黏附分子，使细胞从培养皿表面脱落。将培养皿放入 37℃、5% CO? 的培养箱中孵育 1 - 2 分钟，期间要不时在显微镜下观察细胞是否开始脱落。若细胞未完全脱落，可轻轻敲击培养皿的侧壁，帮助细胞脱离培养皿表面。当细胞大部分脱落形成细胞悬液后，立即加入适量的含血清培养基终止胰蛋白酶的作用，因为胰蛋白酶作用时间过长会对细胞造成损伤，影响细胞的活性和后续生长。

将细胞悬液转移至离心管中，进行离心（条件同前），弃去上清液后，加入新鲜的培养基，用移液管轻轻吹打，使细胞均匀分散在培养基中。按照适当的比例（如 1:2 或 1:3）将细胞悬液分配到新的培养皿中，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布，放入培养箱继续培养。传代后的细胞需要特别关注前 24 小时的生长状态，观察细胞是否能够正常贴壁、恢复生长，如有异常及时采取措施，如调整培养基成分、优化培养条件等，以确保细胞的健康生长和实验的顺利进行。

六、细胞冻存步骤

对于多余的细胞或需要长期保存的细胞系，冻存是常用的保存方法。冻存前，先用胰蛋白酶消化细胞并收集细胞悬液，离心后弃去上清液。加入适量的冻存液（一般冻存液的成分为 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜（DMSO）），轻轻吹打使细胞均匀分散在冻存液中。将细胞悬液分装至冻存管中，每管一般装 1 - 1.5ml。然后将冻存管放入程序降温盒中，使细胞缓慢降温。如果没有程序降温盒，可采用手动降温的方法：先将冻存管放置在 4℃环境下 30 分钟，再转移到 - 20℃环境下放置 1 - 2 小时，最后转移到 - 80℃冰箱中保存 2 - 3 小时，之后迅速将冻存管转移到液氮罐中长期保存。这种缓慢降温的程序可以减少细胞内冰晶的形成，降低细胞在冻存过程中受到的损伤，提高细胞的复苏率。在冻存过程中，要注意保持冻存管的密封性，防止水分进入导致细胞受损，同时做好冻存管的标记，注明细胞名称、冻存日期等信息，以便后续使用时能够快速准确地找到所需的细胞。

七、细胞实验应用要点

（一）细胞功能研究实验操作

永生化小鼠肝窦内皮细胞 - SV40 在肝脏生理学研究中具有重要应用价值。这些细胞具有独特的孔隙结构，允许小分子物质自由通过，同时又能选择性地摄取和清除血液中的大分子物质和颗粒。在进行细胞功能研究实验时，可以利用这一特性，研究肝窦内皮细胞在物质代谢和免疫调节中的作用。例如，通过检测细胞对不同分子量荧光标记物质的摄取和释放情况，评估细胞的内吞和外排功能。同时，可以结合实时荧光定量 PCR 和 Western blot 等技术检测相关基因和蛋白的表达水平，深入探究细胞功能的分子机制。

（二）细胞毒性检测实验操作

在药物研发和毒理学研究中，永生化小鼠肝窦内皮细胞 - SV40 可用于细胞毒性检测。将细胞以适当的密度接种到培养板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的受试药物或化学物质。培养一定时间后，采用细胞计数试剂盒（CCK - 8）检测细胞的存活率。CCK - 8 试剂中的 WST - 8 成分在活细胞线粒体脱氢酶的作用下还原为橙黄色的 formazan 染料，其吸光度值与活细胞数量成正比。通过测定不同浓度组的吸光度值，绘制细胞存活率曲线，评估药物或化学物质对肝窦内皮细胞的毒性作用。同时，可以观察细胞的形态变化，如细胞收缩、脱落等，进一步确认细胞毒性反应。根据实验结果确定药物的安全浓度范围，为药物的安全性评价提供实验依据。

（三）细胞与材料相互作用实验操作

在组织工程和生物材料研究中，研究永生化小鼠肝窦内皮细胞 - SV40 与生物材料的相互作用是一个重要环节。将肝窦内皮细胞种植到不同的生物材料表面（如生物可降解材料、组织工程支架等），可以观察细胞在材料表面的黏附、增殖、分化以及细胞外基质分泌等情况，从而评估材料的生物相容性和对组织修复的支持作用。在进行这类实验时，首先需要对生物材料进行适当的处理和灭菌，确保材料表面清洁、无毒且适合细胞生长。将材料样品放置在培养皿或细胞培养板中，然后将细胞以适当的密度接种到材料表面。在细胞培养箱中孵育一段时间后，通过扫描电子显微镜观察细胞在材料表面的形态和分布情况，了解细胞与材料的初始黏附状态。同时，可以采用一系列的细胞生物学检测方法，如细胞计数试剂盒（CCK - 8）检测细胞的增殖情况，免疫荧光染色检测细胞骨架蛋白（如 F - actin）的排列和相关分化标志蛋白的表达等，综合评估细胞与材料之间的相互作用效果。通过这些实验，可以筛选出适合组织工程应用的生物材料，优化材料的表面特性或组成，以提高细胞的活性和功能，加速组织的修复和再生过程。