永生化婴儿肾上皮细胞系（iBMK）培养与应用详解

一、细胞特性与应用价值

永生化婴儿肾上皮细胞系（iBMK）是一种经过基因改造获得永生化特性的细胞系，保留了正常肾上皮细胞的许多重要特性，如极性、分化能力以及对多种生理和病理刺激的响应能力。这些细胞为肾脏生理学、肾脏疾病机制以及药物毒性研究等提供了理想的体外模型。在细胞生理学研究中，可用于深入研究肾脏上皮细胞的运输功能、信号传导途径以及细胞间通讯等基本生理过程。在肾脏疾病研究领域，可用于模拟和研究各种肾脏疾病的发病机制，如肾小管损伤、肾纤维化等。此外，在药物研发过程中，可用于评估药物对肾脏的潜在毒性，筛选对肾脏具有保护作用的药物。

二、细胞培养前的准备工作

（一）培养设备与器材检查

细胞培养需要在严格的无菌环境下进行，因此对培养设备和器材的检查至关重要。细胞培养箱是维持细胞生长的关键设备，应确保其温度、湿度和 CO? 浓度的控制精准且稳定。一般设定温度为 37℃，湿度保持在 95% 左右，CO?浓度为 5%。定期检查培养箱的水盘是否有足够的水，以维持湿度；同时观察培养箱内的温度和 CO? 浓度是否在设定范围内，如有偏差及时进行校准。

显微镜是观察细胞形态和生长状态的重要工具，需检查其目镜和物镜是否清洁，调节焦距的功能是否正常，以确保能够清晰准确地观察细胞的各种细节。培养皿、离心管等耗材的质量也会影响细胞培养的结果。检查培养皿的表面是否光滑、平整，有无划痕、裂纹等缺陷；离心管是否密封良好，有无破损。使用前，所有耗材都应按照要求进行灭菌处理，一般采用高压灭菌（121℃，15 - 20 分钟）或使用无菌包装的一次性耗材，以避免细菌、真菌等微生物污染细胞。

（二）培养基配制与灭菌

iBMK 细胞的培养基通常由基础培养基和多种添加成分组成。常用的基础培养基为 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）或 Minimum Essential Medium（MEM）。这些基础培养基提供了细胞生长所需的基本营养成分，包括碳水化合物、氨基酸、维生素等。

在基础培养基的基础上，需要添加适量的胎牛血清（FBS），一般添加比例为 10% - 15%。胎牛血清富含多种细胞生长因子、激素、黏附因子等，能够促进细胞的生长和增殖，同时为细胞提供一个类似于体内环境的营养支持。此外，还需要加入青霉素 - 链霉素溶液（通常浓度为 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素），以防止细菌和真菌的污染。部分实验室还会根据实验需求添加其他成分，如胰岛素、表皮生长因子等，以优化细胞的生长环境。

配制好的培养基需要进行高压蒸汽灭菌处理。将培养基分装到合适的容器中，设置压力为 100 - 105 kPa，温度为 121℃，灭菌 15 - 20 分钟。在灭菌过程中，要注意防止培养基过度沸腾导致成分丢失或变性。灭菌完成后，将培养基调至 4℃保存，待使用前再恢复至室温。

三、细胞复苏的规范操作

从冻存状态复苏细胞是细胞培养的起始步骤，正确的操作可以保证细胞的活性和正常生长。首先，准备一个 37℃左右的水浴锅，将含有冻存细胞的冻存管从液氮罐中迅速取出，立即放入水浴锅中，并用镊子快速摇动冻存管，使细胞在 1 - 2 分钟内完全融化。快速融化可以尽量减少细胞在低温到常温过程中受到的损伤，提高细胞的复苏率。

然后，用 75% 的酒精对冻存管外部进行消毒，避免外界细菌、真菌等微生物污染细胞。在无菌操作台内，将冻存管内的细胞悬液快速加入到含有适量培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，使细胞均匀分散在培养基中。接下来进行离心操作，一般设定离心速度为 1000 - 1200rpm，离心时间为 5 分钟左右，使细胞沉淀到离心管底部。离心完成后，小心弃去上清液，注意不要倒掉沉淀的细胞。加入新鲜的培养基，用移液管轻轻吹打细胞沉淀，使其重新悬浮在培养基中。将细胞悬液转移至培养皿中，轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布在整个培养皿表面，放入 37℃、5% CO? 的细胞培养箱中静置培养，让细胞逐渐恢复活性并开始贴壁生长。在复苏后的 24 小时内，要密切观察细胞的生长状态，及时更换培养基，以确保细胞能够顺利适应新的培养环境。

四、细胞培养过程中的观察与记录

定期观察 iBMK 细胞的生长状态是细胞培养过程中的重要环节。通常每天至少观察一次细胞，观察内容包括细胞的形态、颜色、细胞密度以及培养基的情况等。正常生长的 iBMK 细胞呈多边形或纺锤形，细胞边缘清晰，胞质均匀，颜色为淡黄色或透明。

若观察到细胞颜色变深、浑浊，或者出现大量漂浮物，则可能提示细胞受到细菌、真菌或支原体等微生物的污染，或者细胞已经死亡、变性。此时需要立即进行处理，如更换培养基、使用抗生素等，严重污染的细胞可能需要丢弃，以防止污染扩散到其他细胞培养体系中。

同时，要详细记录细胞的生长情况，包括细胞的形态变化、细胞密度的估计值（如以细胞占据培养皿面积的百分比表示）、培养基的更换时间、细胞传代的时间和比例等信息。这些记录有助于了解细胞的生长规律，为后续实验安排提供参考，也有助于在出现问题时追溯原因，及时调整培养条件或采取相应的解决措施。

五、细胞传代的详细步骤

当 iBMK 细胞生长到培养皿面积的 80% - 90% 左右时，需要进行传代操作，以避免细胞因密度过高而出现接触抑制，影响细胞的正常生长和功能。传代前，先用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗培养皿中的细胞，目的是去除细胞表面残留的培养基和一些可能影响细胞传代的杂质。接着，加入适量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用浓度为 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA）到培养皿中，胰蛋白酶可以分解细胞间的黏附分子，使细胞从培养皿表面脱落。将培养皿放入 37℃、5% CO? 的培养箱中孵育 1 - 2 分钟，期间要不时在显微镜下观察细胞是否开始脱落。若细胞未完全脱落，可轻轻敲击培养皿的侧壁，帮助细胞脱离培养皿表面。当细胞大部分脱落形成细胞悬液后，立即加入适量的含血清培养基终止胰蛋白酶的作用，因为胰蛋白酶作用时间过长会对细胞造成损伤，影响细胞的活性和后续生长。

将细胞悬液转移至离心管中，进行离心（条件同前），弃去上清液后，加入新鲜的培养基，用移液管轻轻吹打，使细胞均匀分散在培养基中。按照适当的比例（如 1:2 或 1:3）将细胞悬液分配到新的培养皿中，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布，放入培养箱继续培养。传代后的细胞需要特别关注前 24 小时的生长状态，观察细胞是否能够正常贴壁、恢复生长，如有异常及时采取措施。

六、细胞冻存的标准化流程

对于多余的细胞或需要长期保存的细胞系，冻存是常用的保存方法。冻存前，先用胰蛋白酶消化细胞并收集细胞悬液，离心后弃去上清液。加入适量的冻存液（一般冻存液的成分为 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜（DMSO）），轻轻吹打使细胞均匀分散在冻存液中。将细胞悬液分装至冻存管中，每管一般装 1 - 1.5ml。然后将冻存管放入程序降温盒中，使细胞缓慢降温。如果没有程序降温盒，可采用手动降温的方法：先将冻存管放置在 4℃环境下 30 分钟，再转移到 - 20℃环境下放置 1 - 2 小时，最后转移到 - 80℃冰箱中保存 2 - 3 小时，之后迅速将冻存管转移到液氮罐中长期保存。这种缓慢降温的程序可以减少细胞内冰晶的形成，降低细胞在冻存过程中受到的损伤，提高细胞的复苏率。在冻存过程中，要注意保持冻存管的密封性，防止水分进入导致细胞受损，同时做好冻存管的标记，注明细胞名称、冻存日期等信息，以便后续使用时能够快速准确地找到所需的细胞。

七、细胞实验应用的操作要点

（一）细胞分化诱导实验操作

iBMK 细胞具有一定的分化潜能，可用于研究肾脏上皮细胞的分化机制。在进行细胞分化诱导实验时，首先将细胞培养至适当的密度和状态。然后更换为含有特定分化诱导因子的培养基，如添加视黄酸、地塞米松等成分，这些成分可以诱导细胞向特定的上皮细胞表型分化。在诱导分化过程中，定期更换诱导培养基（一般每 2 - 3 天更换一次），同时观察细胞形态的变化以及检测分化相关标志物的表达情况。可以通过免疫荧光染色检测特定分化标志蛋白的表达，如检测肾小管上皮细胞标志蛋白（如 Aquaporin - 1、Na + /K + - ATPase 等）的表达情况，以评估细胞的分化程度和效果。通过比较不同实验组和对照组的分化结果，可以深入了解分化诱导因子的作用机制以及影响细胞分化的各种因素。

（二）细胞毒性检测实验操作

iBMK 细胞在药物研发和毒理学研究中可用于细胞毒性检测。将细胞以适当的密度接种到培养板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的受试药物或化学物质。培养一定时间后，采用细胞计数试剂盒（CCK - 8）检测细胞的存活率。CCK - 8 试剂中的 WST - 8 成分在活细胞线粒体脱氢酶的作用下还原为橙黄色的 formazan 染料，其吸光度值与活细胞数量成正比。通过测定不同浓度组的吸光度值，绘制细胞存活率曲线，评估药物或化学物质对细胞的毒性作用。同时，可以观察细胞的形态变化，如细胞收缩、脱落等，进一步确认细胞毒性反应。根据实验结果确定药物的安全浓度范围，为药物的安全性评价提供实验依据。

（三）细胞与材料相互作用实验操作

在组织工程和生物材料研究中，研究 iBMK 细胞与生物材料的相互作用是一个重要环节。将 iBMK 细胞种植到不同的生物材料表面（如生物可降解材料、组织工程支架等），可以观察细胞在材料表面的黏附、增殖、分化以及细胞外基质分泌等情况，从而评估材料的生物相容性和对组织修复的支持作用。在进行这类实验时，首先需要对生物材料进行适当的处理和灭菌，确保材料表面清洁、无毒且适合细胞生长。将材料样品放置在培养皿或细胞培养板中，然后将细胞以适当的密度接种到材料表面。在细胞培养箱中孵育一段时间后，通过扫描电子显微镜观察细胞在材料表面的形态和分布情况，了解细胞与材料的初始黏附状态。同时，可以采用一系列的细胞生物学检测方法，如细胞计数试剂盒（CCK - 8）检测细胞的增殖情况，免疫荧光染色检测细胞骨架蛋白（如 F - actin）的排列和相关分化标志蛋白的表达等，综合评估细胞与材料之间的相互作用效果。通过这些实验，可以筛选出适合组织工程应用的生物材料，优化材料的表面特性或组成，以提高细胞的活性和功能，加速组织的修复和再生过程。