在细胞分析领域，细胞骨架的可视化对于研究细胞的形态、运动、分化等过程至关重要。鬼笔环肽（Phalloidin）及其衍生物 AbFluor? 555-Phalloidin（BMD00083）作为经典的肌动蛋白（F-actin）标记试剂，因其高特异性和稳定性而被广泛应用。本文将聚焦于 AbFluor? 555-Phalloidin 的操作使用，为您提供详细的实验指导。

一、实验前准备：奠定成功基础

1. 材料与试剂准备

在开始实验前，确保您已备齐以下关键材料与试剂：

• AbFluor? 555-Phalloidin 染料（BMD00083）
• 无血清细胞培养基（如 DMEM 或 HBSS）
• 4% 多聚甲醛（用于细胞固定）
• 0.1% Triton X-100（用于细胞通透处理）
• 荧光显微镜（配备合适滤光片组）

2. 细胞状态检查

细胞的健康状态直接影响染色效果。在染色前，务必通过倒置显微镜观察细胞形态，确保细胞无污染、形态良好且汇合度适宜（通常为 70%-80%）。对于悬浮细胞，需确认细胞活性高于 90%，可通过台盼蓝排除法进行快速检测。

3. 染料储存条件优化

AbFluor? 555-Phalloidin 染料对光敏感，需避光保存于 -20℃。长期储存时建议分装成小 aliquot，避免反复冻融。使用前需提前置于冰上融化，并轻轻漩涡混匀，确保染料均匀悬浮。

二、染色操作步骤：精准标记细胞骨架

1. 染料溶液配制

根据实验需求选择合适的染料浓度：

• 对于大多数贴壁细胞，推荐初始浓度为 1:50 至 1:200（v/v）。配制方法：取适量 AbFluor? 555-Phalloidin 染料，用无血清培养基稀释至所需浓度。
• 对于神经元等特殊细胞，建议从 1:100 开始测试，因神经元对染料浓度更为敏感。

2. 细胞固定与通透处理

• 对于贴壁细胞：
  1. 吸弃培养基，用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，每次 2 mL。
  2. 加入适量 4% 多聚甲醛，室温固定 15-30 分钟。
  3. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
  4. 加入 0.1% Triton X-100，室温孵育 5-10 分钟以通透细胞膜。
  5. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
• 对于悬浮细胞：
  1. 离心收集细胞（1000 rpm，5 分钟），弃上清。
  2. 用 4% 多聚甲醛重悬细胞，室温固定 15-30 分钟。
  3. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
  4. 用 0.1% Triton X-100 重悬细胞，室温孵育 5-10 分钟。
  5. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。

3. 细胞标记流程

• 对于贴壁细胞：
  1. 加入预配制的 AbFluor? 555-Phalloidin 染料溶液，覆盖细胞层。
  2. 室温避光孵育 30-60 分钟。
  3. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟以去除未结合的染料。
  4. 加入适量抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片。
• 对于悬浮细胞：
  1. 用 AbFluor? 555-Phalloidin 染料溶液重悬细胞，使细胞浓度约为 1×10^6 cells/mL。
  2. 室温避光孵育 30-60 分钟。
  3. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
  4. 用抗荧光淬灭封片剂重悬细胞，滴加于载玻片上，盖上盖玻片。

4. 孵育条件优化

• 温度：多数细胞在室温下孵育效果最佳，但对于某些温度敏感细胞（如某些原代细胞），可尝试在 4℃ 下延长孵育时间至 1-2 小时。
• 时间：根据细胞类型和实验需求调整。例如，标记细胞用于短期观察（如 24 小时内），30-60 分钟孵育即可；若用于长期储存（如 3-5 天），可延长至 90 分钟，但需注意观察细胞状态，避免过度染色导致背景信号升高。

三、染色效果优化：提升实验可靠性

1. 染料浓度调整策略

• 若观察到背景荧光过高，可能是染料浓度过高。建议以 1:10 为梯度，逐步降低浓度进行测试。
• 若荧光信号过弱，可先确认染料是否正确溶解且未降解（可通过荧光光谱仪快速检测）。若染料正常，可尝试以 1:5 为梯度增加浓度，但需同步监测背景信号。

2. 细胞密度控制

细胞密度过高可能导致染料竞争性结合，使部分细胞染色不均。对于贴壁细胞，建议汇合度不超过 80%；悬浮细胞染色时，细胞浓度不宜超过 5×10^6 cells/mL。

3. 染色均匀性保障

• 对于贴壁细胞，在孵育过程中定期轻柔晃动培养皿至关重要。可使用细胞培养专用的摇床，设置转速为 30-50 rpm，确保细胞均匀接触染料。
• 对于悬浮细胞，孵育时可在管架上轻柔旋转离心管，避免细胞沉降。

四、染色后的细胞处理与分析：确保数据准确性

1. 细胞洗涤要点

染色完成后，需彻底去除未结合的染料以减少背景荧光：

• 使用无血清培养基洗涤 2-3 次，每次加入 3-5 mL，轻轻晃动后吸弃。
• 对于需要长期储存的样本，最后一步洗涤可使用含 1% BSA 的 PBS，以减少染料非特异性吸附。

2. 荧光观察与成像

• 荧光显微镜设置：选择 TRITC 滤光片组（激发波长 555 nm，发射波长 565 nm）。
• 成像技巧：对于贴壁细胞，确保载玻片清洁，可使用盖玻片轻压细胞层以减少厚度差异带来的焦距变化。拍摄时从低倍镜开始定位，再切换至高倍镜观察细节。
• 对于悬浮细胞，可使用细胞计数腔或流式细胞仪进行分析。流式细胞仪检测时，需设置合适的前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）阈值以排除碎片干扰。

3. 数据记录与分析

• 记录荧光强度时，需同时采集多个视野的数据，计算平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）以代表细胞骨架染色水平。
• 对于定量分析，可使用 ImageJ 等图像分析软件。在分析前，需对图像进行背景校正，选择相同面积的细胞区域进行测量，排除非细胞区域的干扰。

五、常见问题与解决方案：保障实验顺利进行

1. 荧光信号过弱

• 首先检查染料是否正确溶解且未过期。AbFluor? 555-Phalloidin 染料若储存不当（如未避光、反复冻融）可能导致活性降低。
• 确认细胞状态良好，无污染且活性高于 90%。被感染或处于应激状态的细胞可能摄取染料能力下降。
• 尝试增加染料浓度 1-2 个梯度，并延长孵育时间 10-15 分钟。
• 对于某些难染色细胞（如干细胞、某些癌细胞系），可预先用 0.05% 胶原酶处理 5-10 分钟，轻轻吹打后离心洗涤，再进行染色。

2. 背景荧光过高

• 降低染料浓度 1-2 个梯度，同时缩短孵育时间 5-10 分钟。
• 在染色溶液中添加 1% BSA，可减少染料与蛋白非特异性结合。
• 增加洗涤次数至 4-5 次，延长每次洗涤时间为 8-10 分钟。
• 对于贴壁细胞，染色后增加一步 0.1% 酸性乙醇（pH 2.5-3.0）快速处理 10-20 秒，随后立即用 PBS 洗涤，可有效降低非特异性背景。

3. 细胞脱水导致荧光减弱

• 在封片时，确保抗荧光淬灭封片剂覆盖均匀，避免气泡产生。封片剂需完全覆盖细胞层，厚度保持一致。
• 对于长期储存的样本，建议在观察前重新滴加少量封片剂，轻压盖玻片以补充流失的封片剂。