在细胞分析领域，DiI (DiIC18(3)) 染料（BMD00071）作为一种经典的细胞膜标记试剂，以其操作简便、荧光信号稳定而备受科研工作者青睐。本文聚焦于 DiI 染料的操作使用，为您提供详细的实验指导，以确保您在细胞标记实验中获得可靠的结果。

一、实验前准备：奠定成功基础

1. 材料与试剂准备

在开始实验前，确保您已备齐以下关键材料与试剂：

• DiI 染料（BMD00071）
• 无血清细胞培养基（如 DMEM 或 HBSS）
• 胰酶（用于细胞消化，若涉及细胞传代）
• 胶原酶（针对特定组织解离，按需准备）
• 荧光显微镜或流式细胞仪（配备合适滤光片组）

2. 细胞状态检查

细胞的健康状态直接影响染色效果。在染色前，务必通过倒置显微镜观察细胞形态，确保细胞无污染、形态良好且汇合度适宜（通常为 70%-80%）。对于悬浮细胞，需确认细胞活性高于 90%，可通过台盼蓝排除法进行快速检测。

3. 染料储存条件优化

DiI 染料对光敏感，需避光保存于 -20℃。长期储存时建议分装成小 aliquot，避免反复冻融。使用前需提前置于冰上融化，并轻轻漩涡混匀，确保染料均匀悬浮。

二、染色操作步骤：精准标记细胞膜

1. 染料溶液配制

根据实验需求选择合适的染料浓度：

• 对于大多数贴壁细胞，推荐初始浓度为 5 μg/mL。配制方法：称取 1 mg DiI 染料，溶解于 200 μL DMSO 中，制备成 5 mg/mL 的母液。使用时，取 2 μL 母液加入到 1 mL 无血清培养基中，轻轻混匀。
• 对于神经元等特殊细胞，建议从 1 μg/mL 开始测试，因神经元对染料浓度更为敏感。

2. 细胞染色流程

• 对于贴壁细胞：
  1. 吸弃培养基，用预热的 PBS 洗涤细胞 2 次，每次 2 mL，轻轻晃动培养皿以去除残留培养基。
  2. 加入适量胰酶（根据细胞密度调整用量，通常 0.25%-0.5%），在 37℃ 下孵育 1-2 分钟至细胞边缘出现锯齿状。
  3. 加入 2 mL 含 10% 胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打使细胞脱落，收集细胞悬液于离心管中。
  4. 1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，加入 1 mL 预冷的染料溶液，重悬细胞，使细胞浓度约为 1×10^6 cells/mL。
  5. 将细胞悬液转移至培养皿中，置于 37℃、5% CO? 培养箱中孵育 15-30 分钟。期间可每隔 5 分钟轻轻晃动培养皿，确保细胞均匀接触染料。
• 对于悬浮细胞：
  1. 直接离心收集细胞（1000 rpm，5 分钟），弃上清。
  2. 用预冷的染料溶液重悬细胞，调整细胞浓度至 1-5×10^6 cells/mL。
  3. 室温避光孵育 20-30 分钟，期间可轻柔混匀 2-3 次。
  4. 孵育完成后，加入 2 mL 完全培养基，1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，用培养基重悬细胞。

3. 孵育条件优化

• 温度：多数细胞在 37℃ 下孵育效果最佳，但对于某些温度敏感细胞（如某些原代细胞），可尝试在室温下延长孵育时间至 40-60 分钟。
• 时间：根据细胞类型和实验需求调整。例如，标记细胞用于短期观察（如 24 小时内），15-30 分钟孵育即可；若用于长期追踪（如 3-5 天），可延长至 60 分钟，但需注意观察细胞状态，避免过度染色导致细胞毒性。

三、染色效果优化：提升实验可靠性

1. 染料浓度调整策略

• 若观察到非特异性染色（如细胞内颗粒荧光），可能是染料浓度过高。建议以 1 μg/mL 为梯度，逐步降低浓度进行测试。
• 若荧光信号过弱，可先确认染料是否正确溶解且未降解（可通过荧光光谱仪快速检测）。若染料正常，可尝试以 2 μg/mL 为梯度增加浓度，但需同步监测细胞活性。

2. 细胞密度控制

细胞密度过高可能导致染料竞争性结合，使部分细胞染色不均。对于贴壁细胞，建议汇合度不超过 80%；悬浮细胞染色时，细胞浓度不宜超过 5×10^6 cells/mL。

3. 染色均匀性保障

• 对于贴壁细胞，在孵育过程中定期轻柔晃动培养皿至关重要。可使用细胞培养专用的摇床，设置转速为 30-50 rpm，确保细胞与染料充分接触。
• 对于悬浮细胞，孵育时可在管架上轻柔旋转离心管，避免细胞沉降。

四、染色后的细胞处理与分析：确保数据准确性

1. 细胞洗涤要点

染色完成后，需彻底去除未结合的染料以减少背景荧光：

• 使用无血清培养基洗涤 2-3 次，每次加入 3-5 mL，轻轻晃动后吸弃。
• 对于需要长期培养观察的细胞，最后一步洗涤可使用完全培养基，以补充细胞所需营养成分。

2. 荧光观察与成像

• 荧光显微镜设置：选择 TRITC 滤光片组（激发波长 540-550 nm，发射波长 570-580 nm）。调整光强至中等水平，避免荧光淬灭。
• 成像技巧：对于贴壁细胞，确保培养皿底面清洁，可使用盖玻片轻压细胞层以减少厚度差异带来的焦距变化。拍摄时从低倍镜开始定位，再切换至高倍镜观察细节。
• 对于悬浮细胞，可使用细胞计数腔或流式细胞仪进行分析。流式细胞仪检测时，需设置合适的前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）阈值以排除碎片干扰。

3. 数据记录与分析

• 记录荧光强度时，需同时采集多个视野的数据，计算平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）以代表细胞膜染色水平。
• 对于定量分析，可使用 ImageJ 等图像分析软件。在分析前，需对图像进行背景校正，选择相同面积的细胞区域进行测量，排除非细胞区域的干扰。

五、常见问题与解决方案：保障实验顺利进行

1. 荧光信号过弱

• 首先检查染料是否正确溶解且未过期。DiI 染料若储存不当（如未避光、反复冻融）可能导致活性降低。
• 确认细胞状态良好，无污染且活性高于 90%。被感染或处于应激状态的细胞可能摄取染料能力下降。
• 尝试增加染料浓度 1-2 个梯度，并延长孵育时间 10-15 分钟。
• 对于某些难染色细胞（如干细胞、某些癌细胞系），可预先用 0.2% 胶原酶处理 5-10 分钟，轻轻吹打后离心洗涤，再进行染色。

2. 非特异性染色

• 降低染料浓度 1-2 个梯度，同时缩短孵育时间 5-10 分钟。
• 在染色溶液中添加 1% BSA，可减少染料与蛋白非特异性结合。
• 对于贴壁细胞，染色后增加一次胰酶短暂处理（0.1% 胰酶，室温 30 秒），随后立即添加含 10% 胎牛血清的培养基终止反应，离心洗涤后再观察。

3. 细胞脱落后荧光减弱

• 对于贴壁细胞，染色后需轻柔处理，避免用力吹打导致细胞膜损伤。可使用细胞刮刀轻轻刮取细胞，转移至新培养皿中。
• 在培养基中添加 1 μg/mL DiI 染料，使细胞在后续培养过程中持续补充荧光信号。此方法适用于需要长期追踪（3-7 天）的实验，但需注意监测细胞活性。