胰蛋白酶活性检测试剂盒实验解决方案

原理

胰蛋白酶选择性水解变性蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是一种重要的消化酶。此外，胰蛋白酶还广泛应用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等的辅助治疗。CheKine? 胰蛋白酶活性检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织生物样本。在该试剂盒中，胰蛋白酶催化水解TAME的酯键，释放出的游离羧基与反应体系中的氢氧化钠发生中和反应，导致溶液的pH值降低，以苯酚红为指示剂，测定溶液在555 nm处吸收值的变化，可以快速测得胰蛋白酶活性数据。胰蛋白酶在一定范围内与555 nm处吸收值的降低呈良好的线性关系。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测555 nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管

·水浴锅、低温离心机

·去离子水

·匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Working Reagent ：临用前配制；根据用量按照ReagentⅠ（V）：Reagent II（V）：去离子水（V）：Reagent III（V）=1 mL：1 mL：5.4 mL：0.4 mL的比例充分混合，现配现用。用多少配多少，在空瓶中配制，48 T中带有2个空瓶，96 T中带有4个空瓶。

注意：Reagent II有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。

组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，即粗酶液，置冰上待测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到555 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2.操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

3.混匀后立即测定，记录555 nm下1 min时的吸光值A1和2 min时的吸光值A2。计算△A=A1-A2。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.005，可将反应时间延长到5 min。如果ΔA大于0.5，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

胰蛋白酶活性的计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：室温下每毫克蛋白质每分钟催化555 nm处吸光值减少0.5为1个酶活单位。

胰蛋白酶(U/mg prot)=ΔA×V反总÷(Cpr×V1)÷0.5÷T=80×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：室温下每克组织每分钟催化555 nm处吸光值减少0.5为1个酶活单位。

胰蛋白酶(U/g 鲜重)=ΔA×V反总÷(W×V1÷V2)÷0.5÷T=80×ΔA÷W

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：组织质量，g；V1：加入反应体系中粗酶液体积，5 μL=0.005 mL；V2：粗酶液总体积，1 mL；V反总：反应总体积，0.2 mL；T：反应时间，1 min。